MS-275對食管鱗癌KYSE-70細胞存活、細胞周期、凋亡及遷移的影響

劉騰飛，周建康，黃團結，王亞蘋，周馨魁，張 樂,張璐玉，陳一豪，劉紅濤，關方霞，馬珊珊

鄭州大學生命科學學院 鄭州 450001

食管癌是消化系統最普遍的惡性腫瘤之一，其病死率和發病率分別位居全國惡性腫瘤第4位和第5位[1]。尋找治療食管癌的分子靶向藥物迫在眉睫。MS-275是動物體內具有口服抗癌活性且低毒的苯甲酰胺類組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases，HDAC)抑制劑，屬于Ⅰ類HDAC抑制劑[2]。研究[3-8]發現，MS-275對肝癌、乳腺癌、結腸癌等均展現出良好的抗腫瘤活性，且具有很強的特異性和選擇性。因此，MS-275是一種具有廣泛應用前景的抗腫瘤藥物，但是MS-275在食管鱗癌方面的研究較少。本研究旨在檢測MS-275對食管鱗癌KYSE-70細胞存活、凋亡、細胞周期以及遷移的影響，并分析其對PI3K/Akt/mTOR信號通路相關蛋白p-Akt1和p-mTOR表達的影響，以期為進一步研究MS-275對食管鱗癌的抗腫瘤作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1細胞與主要試劑正常食管上皮Het-1A細胞和食管鱗癌細胞株KYSE-70由鄭州大學第一附屬醫院細胞生物學實驗室保存，MS-275(美國Medchemexpress公司)，標準胎牛血清、RPMI 1640培養基及磷酸鹽緩沖液(以色列BI公司)，CCK-8(日本同仁公司)，凋亡檢測試劑盒(蘇州宇恒生物科技有限公司)，細胞周期檢測試劑盒(江蘇凱基公司)，Transwell 小室(美國Corning 公司)。鼠抗人HDAC1抗體購自CST公司，鼠抗人p-Akt1抗體購自萬類生物科技(沈陽)有限公司，鼠抗人p-mTOR抗體購自圣克魯斯生物技術(上海)有限公司，兔抗人Cyclin D1和E-cadherin抗體購自三鷹生物技術(武漢)有限公司。MS-275溶解于DMSO配制成50 mmol/L的儲存母液。

1.2細胞培養細胞均使用含體積分數10%胎牛血清的RPMI 1640培養基于37 ℃、體積分數5% 的CO2培養箱內培養。

1.3HDAC1mRNA表達的檢測收集對數生長期的KYSE-70和Het-1A細胞，Trizol法提取細胞總RNA，反轉錄合成cDNA，以GAPDH為內參檢測HDAC1 mRNA表達情況。反應條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個循環。引物序列見表1。實驗重復3次。目的基因相對表達量=2-ΔΔCt。

1.4CCK-8法檢測細胞存活情況收集對數生長期KYSE-70細胞并調整細胞濃度至7×104mL-1，接種于96孔板，每孔約7×103個細胞。待細胞貼壁后，分別加入0.00(對照)、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00 μmol/L MS-275，每組設3個復孔。細胞分別培養24、48和72 h后，更換為100 μL含體積分數10% CCK-8溶液的培養基，然后在避光條件下37 ℃孵育2 h，使用酶標儀檢測450 nm波長的吸光度(A)值。實驗重復3次。細胞存活率=(A對照孔-A實驗孔)/(A對照孔-A空白孔)×100%。

1.5細胞周期檢測按1.4方法處理細胞，分別加入0.00、0.25、0.50、1.00和2.00 μmol/L MS-275。細胞繼續培養48 h后，用不含EDTA 的胰酶消化細胞，離心棄上清，PBS洗滌，加入體積分數70%的冷乙醇500 μL，4 ℃固定4～6 h，然后加入100 μL RNase A，37 ℃下水浴30 min，再加入400 μL PI染色，4 ℃避光30 min，最后上流式細胞儀檢測。每組設3個復孔。

1.6細胞凋亡檢測按1.5分組處理KYSE-70細胞，用不含EDTA 的胰酶消化細胞，離心棄上清，PBS洗滌2次，再加入500 μL Binding Buffer懸浮細胞，然后按照要求加入Annexin V-FITC和PI，室溫避光條件下反應5～15 min，1 h內上流式細胞儀檢測。每組設3個復孔。

1.7細胞遷移檢測接種細胞前在6孔板背面畫幾條橫線作標記，然后收集對數生長期的KYSE-70細胞，接種于6孔板中，每孔細胞融合度應在12～24 h達到90%以上。細胞鋪滿孔板底面后，用200 μL移液器槍頭垂直于孔板底面的橫線制造劃痕，這個過程中盡量使每個劃痕寬度一致。劃痕結束后吸棄細胞培養液，用PBS沖洗3次，加入用無血清培養基配制的濃度分別為0.00、0.25、0.50、1.00和2.00 μmol/L MS-275，置細胞培養箱內培養，并于0、48 h進行取樣拍照。實驗重復3次。劃痕愈合率=(0 h劃痕面積-48 h劃痕面積)/0 h劃痕面積×100%。

1.8Westernblot檢測相關蛋白的表達細胞分組及培養同1.5。采用蛋白提取試劑盒提取細胞總蛋白，使用BCA法測蛋白濃度后，加入5×Loading Buffer，100 ℃變性10 min，于-80 ℃保存。采用SDS-PAGE進行蛋白質分離，每孔上樣量為50～200 μg，然后依次經過轉膜、封閉、孵育一抗(p-mTOR按1∶200稀釋，Cleaved caspase-3和p-Akt1按1∶500稀釋，E-cadherin按1∶1 000稀釋，β-actin和Cyclin D1按1∶2 000稀釋)、洗滌、孵育二抗、洗滌和曝光，最后用Image J軟件進行灰度分析，以目的蛋白與β-actin灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達量。實驗重復3次。

1.9統計學處理應用SPSS 19.0分析。采用3×6析因設計的方差分析不同濃度MS-275作用不同時間對KYSE-70細胞存活的影響，應用兩獨立樣本t檢驗比較Het-1A和KYSE-70細胞中HDAC1 mRNA和蛋白表達的差異，應用單因素方差分析比較各組細胞周期、凋亡、遷移情況以及相關蛋白表達的差異，兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α= 0.05。

2 結果

2.1Het-1A和KYSE-70細胞中HDAC1mRNA和蛋白的表達結果見表2。

表2 Het-1A和KYSE-70細胞中HDAC1的表達

2.2MS-275對KYSE-70細胞存活的影響結果見表3。隨著MS-275濃度的增加，細胞存活率降低，處理時間越長，細胞存活率越低。MS-275對KYSE-70細胞存活的影響具有時間和劑量依賴性。后續實驗中選擇作用時間為48 h，作用濃度分別為0.00、0.25、0.50、1.00和2.00 μmol/L。

2.3MS-275對KYSE-70細胞細胞周期、凋亡和遷移的影響結果見表4。隨著MS-275濃度的增加，各組G0/G1期細胞所占比例均顯著增加，S期細胞所占比例減少；細胞的早期凋亡率和晚期凋亡率均明顯增加；劃痕愈合率均顯著減少(P<0.05)。

2.4MS-275對KYSE-70細胞細胞周期、凋亡和遷移相關蛋白表達的影響結果見圖1和表5。隨著MS-275濃度的增加，各組細胞中Cyclin D1蛋白表達量降低，而Cleaved caspase-3、E-cadherin蛋白表達增加(P<0.05)。

2.5MS-275對KYSE-70細胞中p-Akt1和p-mTOR蛋白表達的影響結果見圖2和表5。隨著MS-275濃度的增加，各組細胞中p-Akt1、p-mTOR蛋白表達均明顯降低(P<0.05)。

表3 MS-275對KYSE-70細胞存活率的影響(n=3) %

F時間=399.073,F濃度=402.922,F交互=17.495,P均<0.001

表4 MS-275對KYSE-70細胞周期、凋亡和遷移的影響(n=3) %

*:組間兩兩比較，P均<0.05

1、2、3、4、5：分別為0.00、0.25、0.50、1.00、2.00 μmol/L MS-275

圖1各組細胞中CyclinD1、

Cleavedcaspase-3和E-cadherin蛋白的表達

1、2、3、4、5：分別為0.00、0.25、0.50、1.00、2.00 μmol/L MS-275

圖2 各組細胞中p-Akt1、p-mTOR蛋白的表達表5 各組KYSE-70細胞中Cyclin D1、Cleaved caspase-3、E-cadherin、p-Akt1和p-mTOR蛋白表達水平的比較(n=3)

*:與0.00 μmol/L組比較，P<0.05；#：與0.25 μmol/L組比較，P<0.05；△：與0.50 μmol/L組比較，P<0.05；▲：與1.00 μmol/L組比較，P<0.05

3 討論

腫瘤的發生與基因的表達異常密切相關。組蛋白的乙酰化和去乙酰化是調節基因表達平衡的重要因素，如果平衡被打破就會導致腫瘤的發生。HDAC1 在腎細胞癌、卵巢癌、膽管癌、宮頸癌等多種癌癥中表達上調，而干擾HDAC1 能夠影響癌細胞的生長[9-11]。本研究表明，與Het-1A細胞相比，KYSE-70細胞中HDAC1 mRNA和蛋白表達均明顯增多。MS-275可通過抑制HDAC，提高腫瘤細胞中組蛋白的乙酰化程度，使染色質處于相對松弛的狀態，從而易于轉錄因子與DNA的結合而促進轉錄，隨后激活細胞的多條信號轉導通路，誘導特定基因表達，最終發揮腫瘤抑制作用。

MS-275對淋巴瘤細胞系有明顯的抑制作用，而且這種抑制作用隨MS-275的濃度和時間的增加而升高[12]。本研究發現MS-275可有效抑制KYSE-70細胞的增殖，并具有時間和劑量依賴性。目前MS-275與阿扎胞苷聯用治療非小細胞肺癌、黑素瘤等各種實體瘤已進入Ⅱ期臨床試驗階段，而在乳腺癌的治療方面MS-275和依西美坦聯合用藥已進入了Ⅲ期臨床試驗[13]。目前認為MS-275在淋巴癌、乳腺癌等細胞中的抗腫瘤作用主要表現在誘導細胞凋亡、阻滯細胞周期和抑制細胞遷移。MS-275的抗腫瘤作用機制存在多個方面。MS-275誘導細胞凋亡可以說是對惡性腫瘤的普遍應答。研究[14]顯示，MS-275能強烈誘導肝癌中Caspase-3剪切體的表達，并在一定程度上還能激活Caspase-8。MS-275可增強黑色素瘤細胞對TNF相關凋亡誘導配體(TRAIL)的敏感性[15]。MS-275的另一種常見細胞反應是阻滯細胞周期。p21Waf1/Cip1對細胞周期進程具有抑制作用，研究[16]表明MS-275能明顯上調其在肝癌細胞中的表達。MS-275能通過下調Cyclin D1的表達水平來阻滯白血病細胞的細胞周期，此外還能通過增強細胞中E-cadherin的表達，從而達到抑制其遷移的目的[17]。本研究顯示MS-275可以降低KYSE-70細胞的存活率，抑制細胞遷移，阻滯細胞于G0/G1期并誘導細胞凋亡。Western blot 結果顯示MS-275可顯著提高Cleaved caspase-3和E-cadherin蛋白的表達，降低Cyclin D1蛋白的表達。PI3K/Akt/mTOR信號通路作為細胞內非常重要的信號轉導途徑，在細胞的生長、存活、增殖、凋亡、血管生成、自吞噬等過程中發揮著極其重要的生物學功能，該通路的紊亂會引起包括癌癥在內的一系列的疾病[18-19]。因此，作者進一步檢測了MS-275對PI3K/Akt/mTOR信號通路相關蛋白p-Akt1和p-mTOR表達的影響，結果表明，p-Akt1和p-mTOR蛋白的表達量隨著MS-275濃度的增加而呈現明顯降低的趨勢，提示MS-275對KYSE-70細胞發揮抗腫瘤作用可能是通過PI3K/Akt/mTOR信號通路來實現的。

綜上所述，該研究表明MS-275可能是通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路來發揮對KYSE-70細胞的抗腫瘤作用。該研究為下一步通過體內實驗進行系統分析MS-275對食管癌的抗腫瘤作用奠定了基礎。