食管鱗癌紫杉醇耐藥細胞株的建立及耐藥機制探討

惠怡然，楊珍珍，李岳衡，高 盼，許培榮，范天黎

1)鄭州大學基礎醫學院藥理學教研室 鄭州 450001 2)鄭州人民醫院藥劑科 鄭州 450003 3)鄭州大學藥學院 鄭州 450001

食管癌是常見的惡性消化道腫瘤之一，在我國主要以食管鱗癌為主(占90%以上)[1]。紫杉醇(paclitaxel,PTX)是臨床食管癌治療的一線藥物，作用原理是通過促進微管聚合阻止細胞有絲分裂，從而導致細胞凋亡[2]；但在化療過程中經常出現腫瘤耐藥現象，是導致治療失敗的主要原因[3]。腫瘤對一種化療藥物產生耐藥的同時，也常常會對作用機制不同的其他藥物產生耐藥，即多藥耐藥[4]。在這個過程中往往伴隨著耐藥蛋白以及Bcl-2家族蛋白的變化。體外建立腫瘤耐藥細胞株的方法主要有低劑量持續誘導法和大劑量間歇沖擊法，相比而言，低劑量持續誘導過程繁瑣，持續時間較長。本實驗采用大劑量間歇沖擊結合時間遞增的方法，建立食管鱗癌PTX耐藥細胞株EC1/PTX，并對其耐藥機制進行了初步探討。

1 材料與方法

1.1材料人EC1細胞由本實驗室保存，RPMI 1640培養基、凝膠電泳試劑盒為索萊寶公司產品，胰蛋白酶消化液、CCK-8試劑為碧云天公司產品，基質膠為美國BD公司產品，Transwell小室為美國Corning公司產品，小鼠抗人β-actin單抗購自武漢三鷹公司，兔抗人P-gp、Bcl-2、Bax單抗購自Abcam公司，PTX購自海南中化聯合制藥有限公司，多柔比星(ADM)購自浙江海正藥業，五氟尿嘧啶(5-FU)購自上海旭東海普藥業有限公司，順鉑(CDDP)購自山東羅欣藥業集團股份有限公司。

1.2細胞培養將EC1細胞置于37 ℃、體積分數5%CO2恒溫培養箱中，用含有體積分數10%胎牛血清的RPMI 1640 完全培養基培養。在細胞長勢良好、密度達到90%以上的情況下傳代，用PBS洗去殘留培養基后，用胰蛋白酶消化，之后用培養基終止，按比例傳代繼續培養至后續實驗。

1.3耐藥細胞株EC1/PTX的建立取對數生長期的EC1細胞，以100倍半數抑制濃度(IC50)為誘導劑量用PTX誘導培養2 h，然后撤去含藥培養基，用PBS漂洗3次，加入常規培養基繼續培養，每天換液以去除死細胞。15～20 d后存活的細胞生長恢復，進入對數生長期后進行消化處理，傳代3次后重復上述操作，此階段共作用3次。之后延長藥物作用時間為4 h，重復7次。總計加藥作用10次，誘導過程共歷時8個月，最后得到耐藥細胞株EC1/PTX。

1.4耐藥細胞株EC1/PTX的生物學特性

1.4.1 細胞形態 倒置顯微鏡下觀察EC1和EC1/PTX的形態。

1.4.2 生長曲線及倍增時間 將對數生長期的EC1或EC1/PTX細胞經胰蛋白酶消化后制成單細胞懸液，按照1.0×104個/孔的細胞密度接種到24孔板中，每種細胞接種21孔，每天3孔。每天于相同時間點計數細胞，取3孔平均值，連續計數7 d。以細胞數為縱坐標，時間為橫坐標，繪制生長曲線。根據 Patterson 公式計算倍增時間。倍增時間=Tlg2/lg(Nt/N0)，其中N0為第一次計數的細胞數，Nt為培養th后的細胞數，T為細胞數從N0增至Nt的時間。實驗重復3次。

1.4.3 耐藥指數及交叉耐藥性 制備EC1或EC1/PTX單細胞懸液，按照3×103個/孔的細胞密度接種到96孔板中，24 h后吸出培養基，分別加入含有不同濃度的PTX、ADM、5-FU和CDDP的培養基100 μL，共設9個梯度濃度，每個濃度設3個復孔。于培養箱中培養48 h(5-FU組培養72 h)，每孔加入10 μL CCK-8溶液放置2 h后，用酶聯免疫檢測儀測定450 nm波長處的光密度值，計算IC50及耐藥指數。耐藥指數=耐藥細胞IC50/親本細胞IC50。

1.4.4 細胞遷移及侵襲能力 ①侵襲實驗：將無血清RPMI 1640培養基和基質膠按4∶1比例混勻后，取40 μL涂布到Transwell小室上室面，置于培養箱中孵育1 h。與此同時制備EC1或EC1/PTX單細胞懸液，調整細胞密度為5×105mL-1，取200 μL加入Transwell小室上室中，再在24孔板中加入600 μL含體積分數20%胎牛血清的RPMI 1640培養基。48 h后取出小室放入甲醇中固定30 min，之后用結晶紫染色，漂洗，晾干，顯微鏡下觀察并拍照，計數穿膜細胞數。實驗重復3次。②遷移實驗：不需要在Transwell小室涂布基質膠，其他步驟與侵襲實驗相同。實驗重復3次。

1.4.5 克隆形成能力 制備EC1或EC1/PTX單細胞懸液，以1 000個/孔的細胞密度接種于6孔板，每種細胞設3個復孔，置于培養箱1周，觀察克隆形成情況。用PBS漂洗2次，加入1 mL甲醇固定30 min，PBS漂洗3次，再加入結晶紫染色液30 min，PBS洗去多余結晶紫。克隆形成率=(克隆數/接種細胞數)×100%。

1.4.6 細胞周期及凋亡 ①細胞周期：制備EC1或EC1/PTX單細胞懸液，調整細胞密度為1×106mL-1，體積分數70%乙醇4 ℃固定過夜，第2天加入預冷的PBS 1 mL重懸細胞，離心后移去上清。沉淀中先加入100 μL RNaseA混勻，37 ℃水浴30 min，再加入500 μL PI染色液混勻， 24 h內進行流式檢測。實驗重復3次。②細胞凋亡：制備EC1或EC1/PTX單細胞懸液，以2×105個/孔的細胞密度接種于6孔板中，24 h貼壁后，加入100 nmol 的PTX孵育48 h。收集(1～5)×105個細胞，先加入500 μL的Binding buffer重懸，再加入5 μL的Annexin-FITC混勻，加入10 μL的PI染色液混勻，室溫下避光反應5～15 min，在1 h內上流式細胞儀檢測。實驗重復3次。

1.5EC1/PTX細胞中P-gp、Bcl-2及Bax蛋白的表達收集EC1/PTX或EC1細胞，PBS 清洗 2遍，加入裂解液置于冰上裂解 30 min，低溫離心機 4 ℃、12 000 r/min 離心 10 min，收集上清，BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，根據蛋白體積加入上樣緩沖液，置于100 ℃沸水中約5 min，通過SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白，設置電壓為90 V，約30 min跑完濃縮膠，再調節電壓為120 V，繼續電泳至跑完分離膠，之后設置電壓為100 V，轉膜1 h。室溫封閉2 h，加一抗(P-gp、Bax按 1∶1 000 稀釋，Bcl-2按 1∶2 000 稀釋，β-actin 按 1∶5 000 稀釋) 后4 ℃過夜，加二抗37 ℃孵育2 h。按照儀器要求步驟曝光。使用 Image J 軟件分析，以目的條帶和 β-actin 條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達量。實驗重復3次。

1.6統計學處理采用SPSS 17.0進行數據分析。EC1和EC1/PTX細胞各指標的比較采用兩獨立樣本t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1EC1/PTX的細胞形態學觀察親本細胞EC1貼壁生長，排列均勻，形狀規則。PTX誘導24 h后EC1細胞形態即發生明顯改變，細胞變圓變小；敏感細胞不斷死亡，需每天更換培養基，最后僅存少數貼壁細胞；撤藥10 d后細胞開始增殖，20 d左右可以進行消化傳代，最終形成的耐藥細胞EC1/PTX形態變長，并常呈聚團生長狀態(圖1)。

A：PTX作用前；B：PTX作用24 h；C：撤藥12～15 d；D：撤藥20～22 d；E：EC1/PTX圖1 倒置顯微鏡下觀察PTX作用前后EC1細胞形態變化

(×200)

2.2EC1/PTX的生長曲線及倍增時間生長曲線見圖2。根據生長曲線， EC1和EC1/PTX細胞倍增時間分別為(28.43±0.38)、(33.96±0.96) h，EC1/PTX增殖速度明顯減慢(t=9.306,P<0.001)。

圖2 細胞生長曲線

2.3不同藥物對EC1/PTX細胞的IC50及其耐藥指數IC50結果見表1。與親本細胞EC1相比， EC1/PTX對PTX有較高的耐藥性，對ADM、5-FU具有一定的交叉耐藥性，耐藥指數分別為12.82、3.92、5.04。

表1 IC50測定結果 mg/L

2.4EC1/PTX細胞的遷移、侵襲和克隆形成能力結果見圖3和表2。EC1/PTX的遷移及侵襲能力均強于親本細胞EC1，克隆形成能力弱于EC1。

2.5EC1/PTX細胞的細胞周期及凋亡率結果見

表3、4。與親本細胞EC1相比，EC1/PTX的G0/G1、S期細胞增多，G2/M期細胞減少；100 nmol的PTX作用48 h后凋亡率顯著降低。

圖3 EC1和EC1/PTX細胞平板克隆形成情況表2 EC1/PTX與EC1細胞遷移、侵襲和克隆形成能力的比較

細胞n遷移細胞數侵襲細胞數克隆形成率/%EC131 973±2171 025±26183.53±2.76EC1/PTX32 813±831 777±16149.97±4.97t6.2694.23010.222P0.0030.013<0.001

表3 EC1/PTX與EC1細胞周期的比較 %

表4 EC1/PTX與EC1細胞凋亡率的比較 %

2.6EC1/PTX細胞P-gp、Bcl-2及Bax蛋白的表達Western blot結果(圖4、表5)顯示，與EC1細胞比較，EC1/PTX中耐藥蛋白P-gp和抗凋亡蛋白Bcl-2相對表達量較高，促凋亡蛋白Bax的相對表達量較低。

圖4 EC1和EC1/PTX細胞中不同蛋白的表達表5 EC1/PTX與EC1細胞不同蛋白表達的比較

細胞nP-gpBaxBcl-2EC130.55±0.122.06±0.590.56±0.13EC1/PTX32.96±0.440.88±0.231.82±0.68t9.2013.2423.172P<0.001 0.0320.034

3 討論

本實驗采用大劑量間歇沖擊結合時間遞增的方法成功誘導出食管鱗癌紫杉醇耐藥細胞株EC1/PTX。與親本細胞EC1相比，EC1/PTX生長速度減慢，倍增時間延長；細胞周期重新分布，G0/G1期、S 期分布增多，G2/M期分布減少。有研究[5]認為細胞對化療藥物的敏感性與其自身的周期分布有密切關系，當細胞主要分布于對化療藥物相對不敏感的時期如G0/G1期時，則表現出耐藥性。相同時間、相同劑量的藥物作用下，親本細胞EC1出現明顯的凋亡形態，凋亡率顯著高于EC1/PTX細胞，再次證明EC1/PTX細胞對PTX產生耐藥。EC1/PTX不僅對PTX耐藥，而且對從未接觸過的其他化療藥物ADM、5-FU及CDDP也發生一定程度的交叉耐藥。EC1/PTX細胞體外增殖能力、克隆形成能力均明顯低于親本細胞EC1，這種現象可能與細胞長期被藥物沖擊作用有關，并且與耐藥細胞倍增時間延長的情況相符合，細胞增殖時間越長其對化療藥物越不敏感。

腫瘤細胞產生多藥耐藥最主要的機制是細胞表面膜蛋白介導的藥物外排增加[6]，其中ABC蛋白超家族又是促進藥物外排的一個重要機制，目前研究最多的是三磷酸腺苷結合轉運蛋白B1(ATP-binding cassette B1, ABCB1)，又稱P-gp[7]。另外，細胞凋亡通路受到抑制也在腫瘤耐藥過程中發揮著重要作用。Bcl-2和Bax是Bcl-2家族成員，分別發揮著促進細胞生長和促進細胞凋亡的作用，兩者共同調節細胞的生長，當Bcl-2蛋白表達量升高、Bax蛋白表達量降低時，將抑制細胞凋亡，反之將促進細胞凋亡[8-9]。因此我們采用Western blot實驗來檢測EC1/PTX細胞中P-gp和凋亡相關蛋白表達的變化情況，結果顯示，與親本細胞EC1相比，EC1/PTX中P-gp表達上升，凋亡相關蛋白Bcl-2的表達量上升的同時Bax蛋白表達量下降。

以上研究結果表明EC1/PTX產生了穩定的多藥耐藥表型，其耐藥機制可能與P-gp、Bcl-2蛋白高表達有關。此細胞耐藥模型將有助于我們更深入地研究腫瘤細胞耐藥獲得過程中相關基因及其信號通路的變化。