窖蛋白-1在小鼠不同發育時期成釉細胞中的免疫電鏡觀察

史 璐，白書鋒，李凌云，馮海玲

鄭州大學第一附屬醫院牙體牙髓科 鄭州 450052

胞膜窖(Caveolae)是細胞膜上特異性內陷微區，直徑50～100 nm，主要由膽固醇、鞘磷脂、鞘糖脂和窖蛋白(Caveolin)組成，其中前三者構成Caveolae的脂質核心，形成一個不溶于去垢劑的膜區域[1]。Caveolin是Caveolae的表面標記蛋白，相對分子質量為21 000～25 000，分為1、2、3三型，其中Caveolin-1是Caveolae最重要的表面功能蛋白。Caveolin-1自身形成同源多聚體，或與Caveolin-2結合形成異源多聚體，多表達在內皮細胞、上皮細胞、脂肪細胞和成纖維細胞中[2]；Caveolin-3主要分布于骨骼肌、心肌和平滑肌，在星形膠質細胞和軟骨細胞也有表達[1]。Caveolae和Caveolin在細胞生物學功能中起著關鍵作用，包括細胞的胞吞胞飲、膽固醇和脂質平衡、細胞信號轉導等[1]。作者所在的課題組[3]對不同發育階段小鼠下頜第一磨牙牙胚中Caveolin-1的表達進行了免疫組化研究，發現在不同時期的牙胚上皮細胞中均有Caveolin-1表達，提示其可能在牙齒發育過程中發揮作用。Caveolae通常呈瓶頸狀，也可呈平鋪狀、管狀或形成分離的小泡進而融合成直徑大于100 nm的結構。Caveolae的形狀取決于細胞的生理狀況，如Caveolae耗盡膽固醇時呈扁平狀[4]。不同發育階段成釉細胞中Caveolae/Caveolin-1的形態、超微結構定位仍不清楚。本實驗擬采用透射電鏡及免疫電鏡觀察小鼠牙胚發育過程中成釉細胞Caveolae結構，為深入研究Caveolae和Caveolin-1在牙胚發育及成釉細胞生物學功能中的作用提供組織學參考。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器兔抗小鼠Caveolin-1單克隆抗體購自Cell Signaling Technology公司；10 nm膠體金標記羊抗鼠二抗、飽和苦味酸購自Sigma-Aldrich公司。LR White樹脂套裝、200網孔鍍膜鎳網、戊二醛、醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛均購自北京中興百瑞科技有限公司。鋨酸購自上海勁馬生物科技有限公司。全自動組織脫水機、組織包埋機、組織切片機、攤片烤片機、顯微鏡病理成像系統、UC6型超薄切片機均購自德國Leica公司。日本日立H-7650型透射電子顯微鏡。

1.2標本來源交配6～8周齡、體健的C57BL/6小鼠由山東大學實驗動物中心提供，胎齡計算以小鼠交配見到陰道栓后的中午定為胚胎發育第0.5天，新生小鼠出生當天中午定為出生第0.0天。取胚胎發育第16.5天和第18.5天以及出生第2.0天的新生鼠下頜第一磨牙牙胚用于本實驗研究。每個時期取3個樣本。胎鼠牙胚取出后立即置于4 ℃、30 g/L多聚甲醛(pH=7.4)固定12 h備用。出生第2.0天的牙胚固定后，經EDTA脫鈣7 d備用。

1.3牙胚HE染色上述標本經常規石蠟包埋后，5 μm 厚連續冠狀切片，HE染色，中性樹膠封片。光學顯微鏡下觀察并拍照。

1.4成釉細胞超微結構觀察將標本置于體積分數1%鋨酸中室溫固定2 h，乙醇和丙酮聯合梯度脫水，環氧樹脂812包埋，制備70 nm超薄切片，經醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙染色，于透射電鏡觀察成釉細胞超微結構并拍照。

1.5成釉細胞中Caveolin-1的免疫電鏡定位標記采用包埋后膠體金染色技術。①樣品制備：將標本置于固定劑中冰上固定4 h(固定劑配方：40 g/L多聚甲醛+體積分數0.1%戊二醛+體積分數0.06%苦味酸+0.1 mol/L二甲砷酸鈉，pH=7.4)。PBS緩沖液(0.1 mol/L， pH=7.4)冰上漂洗4次×15 min/次；逐級乙醇4 ℃脫水。體積分數100%乙醇-LR White置換及純LR White浸透過夜，最后包埋于0.5 mL 離心管中，室溫下放置3 h，50 ℃聚合3 h，再置于常溫環境中以保證LR White凝固。制備70 nm超薄切片，收集在200網孔的鍍膜鎳網上。②免疫染色：超薄切片以體積分數10%正常羊血清封閉1 h后加入一抗(按1∶1 000稀釋)室溫作用2 h；PBS緩沖液洗滌3次×1 min/次，陰性對照片不加一抗；加入1∶40稀釋的膠體金標記的羊抗鼠二抗，室溫下孵育2 h；PBS緩沖液洗滌3次×1 min/次。最后經醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙染后，透射電鏡觀察并拍照。金標蛋白結合處可見黑褐色顆粒。

2 結果

2.1不同發育時期小鼠成釉細胞HE染色及超微結構觀察結果見圖1、2。胚胎發育第16.5天(帽狀期)，成釉器呈帽狀，內釉上皮呈矮柱狀，單層排列；電鏡下內釉上皮細胞中可見粗面內質網、線粒體、細胞連接等細胞器，細胞膜上可見燒瓶狀凹陷結構。胚胎發育第18.5天(鐘狀期)，成釉器進一步分化，內釉細胞分化為前成釉細胞，呈立方狀；電鏡下細胞膜表面亦可見燒瓶狀凹陷結構。出生第2.0天(鐘狀晚期)，成釉細胞發育成熟，呈高柱狀，細胞核極性倒置，遠離基底膜，成釉細胞開始分泌釉基質；電鏡下成釉細胞中可見大量粗面內質網，管腔較大，細胞質內有大量形狀不一大小不等的囊泡、分泌顆粒和纖維樣成分，說明成釉細胞已分化成熟，具有分泌功能，同時細胞膜上亦可見燒瓶狀凹陷性結構。

A、B：胚胎第16.5天；C、D：胚胎第18.5天；E、F：出生第2.0天。A:×200; C、E:×100; B、D、F:×400。iee：內釉上皮; oee：外釉上皮; sr：星網狀層; si：中間層; dp：牙乳頭; ab：成釉細胞; ob：成牙本質細胞

圖1不同發育時期小鼠下頜第一磨牙牙胚HE染色結果

A、B：胚胎第16.5天；C、D：胚胎第18.5天；E、F：出生第2.0天。A、C、E:×10 000；B、D、F:×30 000。細胞膜表面燒瓶狀凹陷性結構如箭頭所示并局部放大；rer：粗面內質網；m：線粒體；n：細胞核；j:細胞連接；g：高爾基復合體；sg:分泌顆粒；f：纖維樣成分；v：囊泡

圖2不同發育時期小鼠成釉細胞超微結構透射電鏡觀察結果

2.2不同發育時期小鼠成釉細胞中Caveolin-1的定位觀察結果見圖3。從小鼠胚胎第16.5天的牙胚上皮細胞至小鼠出生第2.0天的成釉細胞中均可見到Caveolin-1免疫陽性顆粒沉積，主要定位于細胞膜及細胞質內。小鼠出生第2.0天成熟成釉細胞中的粗面內質網腔內也發現有免疫陽性顆粒沉積。

A：胚胎第16.5天；B：胚胎第18.5天；C：出生第2.0天。箭頭所示為免疫陽性顆粒；rer：粗面內質網；n：細胞核圖3 不同發育時期小鼠成釉細胞中Caveolin-1免疫電鏡觀察結果(SP，×40 000)

3 討論

本實驗首先利用HE染色和透射電鏡觀察了不同發育階段成釉細胞的組織學和超微結構，發現隨著成釉細胞的分化，細胞的形態及超微結構都發生了顯著變化：細胞形態從矮立方狀變為高柱狀；細胞核遠離基底膜，極性倒置；細胞器數量逐漸增多，粗面內質網和高爾基復合體數目增加，胞質中出現大小不等的分泌顆粒，意味著成釉細胞從未分化狀態逐漸分化為成熟的、具有分泌功能的細胞。這些與其他學者[5-6]的研究結果一致。

免疫電鏡觀察可見，成釉細胞細胞膜表面有Caveolin-1免疫膠體金顆粒沉積，說明在成釉細胞的細胞膜表面存在Caveolae結構。Caveolae和Caveolin在多種細胞生物學功能中起到關鍵作用，特別是與細胞信號轉導、胞吞胞飲、膽固醇轉運、血管生成等密切相關。許多信號分子均聚集在Caveolae區，Caveolae被認為是細胞信號轉導平臺， Caveolin-1處于該平臺中各個信號通路的中心位置。在牙胚發育過程中，Caveolin-1 mRNA在胚胎第9.5天第一鰓弓間充質細胞中及胚胎第16.5天下頜第一磨牙牙胚細胞中均有表達，且表達水平增加[7]。研究[3]發現，自牙胚發育的第13.5天，牙胚上皮中即可檢測到Caveolin-1的表達；隨著牙胚的發育，Caveolin-1始終表達于內釉上皮細胞和成釉細胞中，且Caveolin-1 mRNA表達水平逐漸升高，在出生第2.0天增加最為顯著。在體外培養的成釉細胞中，封閉Caveolin-1基因可降低高糖型細胞外基質金屬蛋白酶誘導物和基質金屬蛋白酶-2的表達[8]。這些研究結果表明Caveolin-1參與了牙胚發育和成釉細胞的生物學活動。

本實驗在成熟成釉細胞的內質網腔中也觀察到了Caveolin-1免疫膠體金顆粒沉積。有研究[9]認為Caveolin-1是在內質網中合成組裝完成的。此外，根據鈣釋放激活鈣通道(calcium release-activated calcium channel, CRAC)理論，CRAC是非興奮性細胞鈣離子內流的主要通道，它的開啟是由鈣庫耗竭所激發的，內質網則是細胞內鈣離子儲庫。研究[10]表明：CRAC可能是釉質成熟過程中成釉細胞鈣攝入的關鍵性機制，相關成員的基因突變可導致釉質發育缺陷。第二信使三磷酸肌醇(inositol triphosphate, IP3)與內質網上的IP3受體結合導致內質網鈣離子短暫而迅速的釋放，內質網鈣濃度的下降激活了位于胞膜的CRAC通道, 導致細胞外鈣通過胞膜持續流入，Caveolae被認為是IP3釋放的位點[11]。同時，有學者[11]認為Caveolin-1可能通過3種途徑調節細胞質鈣離子流的形成，其中，攜帶有鈣離子的Caveolae囊泡可能通過鞘糖脂肌醇錨定受體參與的細胞內吞作用將鈣離子運輸至鄰近的內質網。并且有研究[11]發現細胞質中有些內質網富集于富含Caveolin-1的細胞膜區域，這樣Caveolae囊泡不必遷移過遠即可將大量的鈣離子運輸至這些內質網。本研究中觀察到的內質網腔中有Caveolin-1免疫膠體金顆粒沉積的現象能否成為支持上述理論和假說的組織學證據還需要進一步的驗證。但可以肯定的是：牙釉質是高度礦化的組織，健康牙釉質的形成依賴于穩定的鈣離子供給。釉質形成過程中，成釉細胞發揮著上皮性半透膜的功能轉運鈣離子。成釉細胞既要操控大量鈣離子的轉運，同時還要避免過量鈣離子的毒性作用[12]。成釉細胞必須精確調節、緩沖鈣離子流，控制細胞器中鈣離子的儲存、釋放和排出。Caveolae/Caveolin-1在細胞鈣離子轉運中發揮了重要作用，因此有必要對Caveolae/Caveolin-1在成釉細胞鈣離子轉運中的作用進行深入研究。