Let-7d靶向LOX-1逆轉ox-LDL誘導血管內皮細胞凋亡觀察

閆 杰，陳 靜，黃宇玲，葛慶鋒，刁增利，蘇鵬宇，李 燕

1)華北理工大學附屬醫院心血管內科 河北唐山 063000 2)華北理工大學生命科學學院 河北唐山 063000

動脈粥樣硬化是大、中動脈動脈壁的一種慢性炎癥性疾病，其特征是形成可部分或完全阻塞血管腔的動脈粥樣硬化斑塊[1]。氧化低密度脂蛋白(oxidized-low density lipoprotein，ox-LDL)在動脈粥樣硬化形成中發揮重要作用[2]。凝集素樣氧化低密度脂蛋白清除受體1(lectin-like oxidized low-density lipoprotein scavenger receptor-1，LOX-1)是負責結合、內化和降解ox-LDL的主要受體之一[3]。LOX-1的激活與許多病理生理事件有關，包括內皮細胞和血管平滑肌細胞增殖、細胞周期信號改變及細胞凋亡等[4]。研究[4]表明，動脈粥樣硬化區域細胞凋亡顯著增加，研究ox-LDL誘導的血管內皮細胞凋亡將有助于了解動脈粥樣硬化的發生發展機制。

miRNA是非編碼單鏈分子，由約22個核苷酸組成，可在轉錄水平上調控基因表達，miRNA與炎癥、氧化應激和血管生成有關[5]。Let-7家族已被證實能夠通過與mRNA的3’-UTR結合來抑制目的基因的表達[6]，在炎癥、動脈粥樣硬化進展中起著至關重要的作用[7-8]。Qin等[7]研究表明let-7c可通過抑制Bcl-xl來促進內皮細胞凋亡。Chen等[9]研究報道了let-7g與LOX-1之間負反饋調節，LOX-1 mRNA的3’-非翻譯區上含有let-7g結合位點。Bao等[10]研究報道，在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者中Let-7d和Let-7i表達下調，提示Let-7d可能在動脈粥樣硬化中起作用。本研究證實了ox-LDL能夠誘導人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)中Let-7d表達降低，并且過表達Let-7d可通過靶向LOX-1表達來逆轉ox-LDL對血管內皮細胞凋亡的誘導作用，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗材料HUVECs購自美國ATCC；胎牛血清、RPMI 1640培養基、OPTI-MEM培養基、青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶、Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；ox-LDL購自北京索萊寶科技有限公司；miRNA反轉錄試劑盒購自中國大連寶生物科技有限公司；KAPA SYBR FAST qPCR試劑盒購自美國KAPA Biosystems公司；miRNA 模擬物對照(NC)、Let-7d模擬物購自上海吉瑪公司；pmirGLO質粒、Dual Luciferase?Reporter Assay System購自Promega公司；Ⅷ因子抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司；LOX-1抗體購自美國Sigma公司，Caspase 3、Bax、Bcl-2、GADPH抗體購自CST公司；辣根過氧化物酶聯二抗和ECL發光液購自德國Merck Millipore公司。

1.2細胞培養及分組將HUVECs用含有體積分數10%胎牛血清和青、鏈霉素的RPMI 1640培養基，于37 ℃、體積分數5% CO2的培養箱中培養，待細胞融合度達到80%時，用胰蛋白酶消化并傳代。用50 mg/L的ox-LDL分別處理HUVECs 0、24和48 h[11]，分別記為0 h組、24 h組和48 h組。將對數生長期HUVECs消化，取1×105個細胞接種于24孔板中，分為4組，每組3個復孔，待細胞貼壁后融合度達50%時，用Lipofectamine 2000和OPTI-MEM培養基將NC與Let-7d轉入細胞中，6 h后其中2組更換新鮮培養基，另外2組更換含有50 mg/L的ox-LDL的培養基，放入細胞培養箱繼續培養至48 h，分別記為NC組、Let-7d組、NC+ox-LDL組和Let-7+ox-LDL組。

1.3HUVECs中Let-7d表達的RT-qPCR檢測按照Trizol說明書提取各組細胞總RNA，采用miRNA反轉錄試劑盒進行反轉錄并于PCR儀上檢測Let-7d的表達，以U6作為內參，用2-ΔΔCt法計算Let-7d相對表達量。循環步驟為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，40個循環；然后進行熔解曲線分析。使用的引物序列如下。Let-7d：上游引物5’-AGGTTGCATAGTTTTAGGGCA-3’,下游引物5’-AAGGCAGCAGGTCGTATAGT-3’;U6：上游引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’,下游引物5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。實驗重復3次。

1.4HUVECs中相關蛋白表達的Westernblot法檢測取處理后的細胞用冷PBS洗2次，RIPA裂解

液提取總蛋白，BCA法測蛋白濃度并經SDS-PAGE電泳分離各組樣品，蛋白分離后進行轉膜至PVDF膜，50 g/L脫脂牛奶封閉后分別用LOX-1、Caspase 3、Bax、Bcl-2和GADPH(內參)抗體以及辣根過氧化物酶聯二抗孵育，最后于曝光儀上用ECL發光液曝光顯影。用Image J軟件分析LOX-1、Caspase 3、Bax和Bcl-2蛋白的相對表達量。實驗重復3次。

1.5Let-7d與LOX-1靶向調控關系的分析采用雙熒光素酶報告基因實驗進行Let-7d與LOX-1靶向調控關系的分析。采用TargetScan(http://www.targetscan.org/)在線預測網站檢測到LOX-1 3’UTR與Let-7d存在結合位點，猜測LOX-1可能是Let-7d的一個靶基因。用Trizol提取細胞總RNA并反轉錄為cDNA，使用LOX-1的3’UTR引物進行PCR擴增，并將其克隆至pmirGLO，構建pmirGLO-LOX-1-WT載體。利用TaKaRa點突變試劑盒突變pmirGLO-LOX-1-WT上Let-7d結合位點來構建pmirGLO-LOX-1-Mut載體。利用Lipofectamine 2000將LOX-1-WT或LOX-1-Mut報告載體聯合NC或Let-7d轉染至HUVECs中，48 h后使用Dual Luciferase?Reporter Assay System試劑盒檢測各組細胞熒光素酶活性。實驗重復3次。

1.6HUVECs凋亡檢測取1×106個對數生長期HUVECs接種至6孔板中，在培養基中加入終濃度為50 mg/L的ox-LDL，培養48 h；另取轉染NC或Let-7d后的HUVECs加入50 mg/L的ox-LDL繼續培養48 h。用不含EDTA的胰蛋白酶消化收集細胞，冷的PBS洗2次，上流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況。實驗重復3次。

1.7統計學處理采用SPSS 21.0進行統計學分析。0 h組、24 h組和48 h組間LOX-1蛋白表達及Let-7d表達的比較均采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；NC組和Let-7d組間熒光素酶活性的比較采用兩獨立樣本的t檢驗；NC組、Let-7d組、NC+ox-LDL組和Let-7d+ox-LDL組間LOX-1蛋白和mRNA表達、細胞凋亡率及Caspase 3、Bax、Bcl-2蛋白表達的比較均采用2×2析因設計的方差分析。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1ox-LDL誘導HUVECs中LOX-1和Let-7d表達的變化結果顯示，ox-LDL誘導細胞中LOX-1表達增加，Let-7d表達降低(圖1、表1)。

1：0 h組；2：24 h組；3：48 h組圖1 ox-LDL誘導HUVECs中LOX-1蛋白的表達表1 3組HUVECs中LOX-1蛋白及Let-7d相對表達量的比較

組別nLOX-1蛋白相對表達量Let-7d相對表達量0 h組30.19±0.020.98±0.0424 h組30.41±0.04*0.49±0.05*48 h組30.52±0.03*#0.34±0.03*#F70.580201.700P<0.001<0.001

*：與0 h組相比，P<0.05；#：與24 h組相比，P<0.05

2.2Let-7d與LOX1的靶向調控關系TargetScan在線預測網站預測發現LOX-1是Let-7d潛在靶基因，LOX-1 3’UTR中含有與Let-7d反向互補結合的核苷酸序列(圖2)。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，Let-7d顯著降低了LOX-1-WT熒光素酶活性，而對LOX-1-Mut熒光素酶活性無影響(表2)。

圖2 Let-7d與LOX-1的3’UTR互補結合表2 2組HUVECs中熒光素酶活性比較

組別n熒光素酶活性LOX-1-WTLOX-1-MutNC組30.97±0.061.02±0.08Let-7d組30.37±0.040.97±0.09t14.4100.719P<0.0010.512

2.3Let-7d對HUVECs中LOX-1mRNA和蛋白表達的影響結果見圖3、表3。

2.4Let-7d對ox-LDL誘導HUVECs凋亡及相關蛋白表達的影響結果見圖4、表4。

1：NC組；2：NC+ox-LDL組；3：Let-7d組；4：Let-7d+ox-LDL組

圖3 各組HUVECs中LOX-1蛋白表達的檢測表3 各組HUVECs中LOX-1蛋白和mRNA相對表達量的比較

1：NC組；2：NC+ox-LDL組；3：Let-7d組；4：Let-7d+ox-LDL組圖4 各組HUVECs中凋亡相關蛋白表達的檢測表4 各組HUVECs細胞凋亡率及Caspase 3、Bax、Bcl-2蛋白相對表達水平的比較

組別n細胞凋亡率/%Caspase 3BaxBcl-2NC組34.75±0.580.84±0.080.29±0.031.15±0.13NC+ox-LDL組317.97±2.351.95±0.160.83±0.090.22±0.02Let-7d組33.97±0.460.88±0.090.21±0.021.28±0.14Let-7d+ox-LDL組39.31±1.021.13±0.110.55±0.050.64±0.06FLet-7d(P)8.358(0.028) 11.765(<0.001) 14.226(0.006)16.582(<0.001)Fox-LDL(P)26.845(<0.001)25.824(<0.001) 32.475(<0.001)22.437(<0.001)F交互(P)14.243(<0.001)15.429(<0.001) 24.725(<0.001)9.852(0.013)

3 討論

內皮細胞功能障礙是動脈粥樣硬化的一個關鍵特征，其中包括內皮細胞增殖缺陷和異常的細胞凋亡[12]。動脈粥樣硬化中的高脂血通常會導致內皮細胞損傷、死亡以及從血管壁的分離，進而失去對白細胞的抗黏附性作用，增加內皮壁對循環脂質的滲透性，最終導致動脈粥樣硬化病變形成[13]。因此，內皮細胞對維持內皮細胞壁完整性是必不可少的，其通過修復血管來抵抗損傷。已有研究[14]證實，高脂血癥導致的ox-LDL水平升高能夠通過抑制內皮細胞增殖所必需的堿性成纖維細胞生長因子表達來抑制內皮細胞增殖。LOX-1表達于內皮細胞膜上，動脈粥樣硬化病理狀態下，LOX-1通常高表達，急性炎癥條件下，LOX-1細胞外結構域可作為可溶性LOX-1(sLOX-1)從細胞膜釋放到血液循環中，sLOX-1現已作為動脈粥樣硬化的一個潛在診斷和預后指標[15-16]。LOX-1是ECs攝取ox-LDL的主要受體，在ox-LDL致HUVECs毒性作用中起了關鍵作用[17]。內皮特異性LOX-1過度表達增加主動脈ox-LDL水平，導致內皮功能障礙、血管炎癥和斑塊形成[18]。因此，抑制LOX-1的表達來逆轉ox-LDL誘導的內皮細胞凋亡可能代表了遏制動脈粥樣硬化發生發展的治療新機制[19]。

先前的研究[4]表明，ox-LDL能夠刺激內皮細胞中LOX-1的表達，且ox-LDL被LOX-1攝取，可誘導細胞發生病理變化，包括衰老和細胞凋亡，本研究結果與其一致：用50 mg/L的ox-LDL處理HUVECs可上調LOX-1表達，并且也可誘導細胞凋亡增加。有研究[13]表明，升高的LOX-1亦進一步促進了細胞對ox-LDL的攝取，ox-LDL/LOX-1正反饋環路可能進一步促進了疾病的發展，提示LOX-1可能是治療血管內皮功能障礙的靶標。基于LOX-1在ox-LDL誘導內皮細胞凋亡中的作用，作者猜測miRNA可能參與調控ox-LDL誘導的HUVECs中LOX-1的表達和活性。通過TargetScan生物信息學分析發現LOX-1是Let-7d的潛在靶標，并且ox-LDL可下調Let-7d的表達，這與ox-LDL誘導LOX-1表達結果呈相反趨勢。為進一步研究Let-7d和LOX-1之間調控關系，本研究利用雙熒光素酶報告基因實驗證實了Let-7d能夠直接結合LOX-1 mRNA的3’UTR種子序列。此外，本研究將Let-7d模擬物轉染至HUVECs中，亦發現其可抑制ox-LDL誘導的LOX-1表達，上述結果表明，Let-7d能夠靶向結合LOX-1的3’UTR抑制LOX-1表達。

細胞凋亡是通過涉及死亡受體或線粒體信號傳導途徑的兩個主要信號途徑誘導的。在線粒體凋亡信號通路中，細胞膜電位發生改變，導致細胞色素c的釋放和Caspase信號通路的激活，Caspase 3被認為是凋亡過程中的關鍵因子或調節因子[20]。細胞凋亡也受到幾種凋亡相關蛋白的調節，包括作為抗死亡因子的Bcl-2和促凋亡因子的Bax[21]。研究[11]證實，ox-LDL能夠通過與LOX-1相互作用參與調控Fas介導的內皮細胞凋亡，并且ox-LDL 通過 LOX-1 下調抗凋亡蛋白Bcl-2和抑制性細胞凋亡蛋白1的表達，從而激活細胞凋亡信號轉導途徑，誘導細胞凋亡。在本研究中，ox-LDL在增加LOX-1蛋白表達水平的同時，增加了Caspase 3和促凋亡蛋白Bax的表達，降低了抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，而轉染Let-7d后則逆轉了ox-LDL對Caspase 3和Bax的誘導作用，并促進了抗凋亡蛋白Bcl-2的表達。

總之，本研究結果表明，Let-7d通過抑制ox-LDL對HUVECs中LOX-1表達的誘導，逆轉了ox-LDL誘導的內皮細胞凋亡，對內皮細胞起到一定的保護作用。本研究結果將可能為內皮損傷的分子機制和動脈粥樣硬化的發病機制提供新見解，Let-7d可能成為治療動脈粥樣硬化中內皮細胞功能障礙的新靶標。