蛛網(wǎng)膜下隙注射miR-30b對脊髓Nav1.3表達及神經(jīng)病理性疼痛的影響

茹靖濤，李 鳴，蘇松雪，蔡偉華，曹 靖，臧衛(wèi)東，邵金平

1)河南省人民醫(yī)院骨二科 鄭州 450003 2)鄭州大學基礎(chǔ)醫(yī)學院人體解剖學系 鄭州 450001

電壓門控鈉離子通道亞型1.3(voltage-gated sodium channels subtype 1.3，Nav1.3)由基因Scn3A編碼，在嚙齒類動物中主要表達于胚胎神經(jīng)元，于孕17 d達到峰值，出生15 d后降低，30 d后僅微量表達。盡管在成年大鼠背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglia DRG)中僅能檢測到少量Nav1.3的表達，但在神經(jīng)病理性疼痛時，DRG中的Nav1.3會重新高表達，并與神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1-2]。然而Nav1.3參與神經(jīng)病理性疼痛的調(diào)控機制尚不明確。microRNAs (miRNAs)是一類具有19～25個核苷酸的非編碼RNA，其主要作用于轉(zhuǎn)錄后基因表達的調(diào)節(jié)。miR-30b是一個miRNA分子，參與癌癥和神經(jīng)退行性疾病等；通過生物信息學軟件TargetScan預測miR-30b與編碼Scn3A的3’UTR區(qū)堿基互補配對。本研究通過制作大鼠脊神經(jīng)結(jié)扎(spinal nerve ligation，SNL)神經(jīng)病理性疼痛模型，利用熒光定量PCR、免疫熒光染色和Western blot方法，探討miR-30b調(diào)控Nav1.3 參與神經(jīng)病理性疼痛的中樞機制。

1 材料與方法

1.1miR-30b與Scn3A靶標關(guān)系的驗證

1.1.1 主要材料和試劑 本研究使用的miR-30b的類似物(agomir)、抑制劑(antagomir)、擾亂序列(scramble)以及重組野生型(WT)和突變型(Mut)pmirGLO雙熒光素酶報告基因載體均由上海吉瑪制藥有限公司提供(野生型載體為攜帶與miR-30b配對的Scn3A 3’UTR區(qū)的質(zhì)粒，而突變型為攜帶Scn3A 3’UTR區(qū)亂序的質(zhì)粒)。

1.1.2 細胞的轉(zhuǎn)染及分組 將大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤PC12細胞以5×104mL-1接種于24孔板中, 置于37 ℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 細胞密度達50%時用于轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前3 h將細胞培養(yǎng)基換成不含血清的新鮮培養(yǎng)基。實驗共分8組(每組均設(shè)3個復孔)：WT+scramble組(用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法共轉(zhuǎn)染野生型Scn3A 3’UTR載體和miR-30b的scramble序列50 pmol/L)、 WT+agomir組(共轉(zhuǎn)染野生型Scn3A 3’UTR載體和miR-30b agomir 50 pmol/L)、WT+antagomir組(共轉(zhuǎn)染野生型Scn3A 3’UTR載體和miR-30b antagomir 50 pmol/L)、WT+NC組(共轉(zhuǎn)染野生型Scn3A 3’UTR載體和miR-30b antagomir陰性對照50 pmol/L)、Mut+scramble組(共轉(zhuǎn)染突變型SCN3A 3’UTR載體和miR-30b的scramble序列50 pmol/L)、Mut+agomir組(共轉(zhuǎn)染突變型Scn3A 3’UTR載體和miR-30b agomir 50 pmol/L)、Mut+antagomir組(共轉(zhuǎn)染突變型Scn3A 3’UTR載體和miR-30b antagomir 50 pmol/L)和Mut+NC組(共轉(zhuǎn)染突變型Scn3A 3’UTR載體和miR-30b antagomir陰性對照50 pmol/L)。共轉(zhuǎn)染后，培養(yǎng)6 h，換為含體積分數(shù)10%血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細胞。

1.1.3 各組細胞中熒光素酶活性的檢測 吸出待檢細胞的培養(yǎng)基，PBS洗3次后，每孔加入100 μL裂解液，置于搖床振蕩20 min，充分裂解細胞。12 000 r/min離心5 min。取上清20 μL，加入96孔白板，每樣3個復孔，使用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(Promega)在Berthold Centro LB960 luminometer (Berthold Technologies)上檢測螢火蟲熒光強度與海腎素熒光強度的比值。

1.2大鼠SNL模型的制備及分組選用體重260～320 g的清潔級成年雄性SD大鼠(由河南省實驗動物中心提供)。體積分數(shù)2%異氟烷麻醉后，剃除背部骶部區(qū)域的毛，取俯臥位，體積分數(shù)10%聚維酮碘消毒、鋪巾，左側(cè)后背部L2～S1處依次縱行切開皮膚、筋膜、肌肉，約3 cm長切口(距背中線1.0 cm)。鈍性分離左側(cè)棘突至骶骨的椎旁肌肉，充分暴露L4-6椎體側(cè)緣和L5脊神經(jīng)，結(jié)扎L5脊神經(jīng)。假手術(shù)組則只暴露L5脊神經(jīng)，其余過程同手術(shù)組。術(shù)后觀察大鼠恢復情況，如出現(xiàn)神經(jīng)功能障礙(如癱瘓)或狀態(tài)不佳者，則剔除實驗。實驗共分4組(每組6只大鼠)：假手術(shù)組、SNL組(只進行SNL手術(shù)的大鼠)、SNL+scramble組[SNL大鼠鞘內(nèi)置管注射miR-30b的擾亂序列(20 μmol/L，10 μL)，術(shù)后第10 天開始注射，連續(xù)注射4 d，1次/d]和SNL+agomir組[SNL大鼠鞘內(nèi)置管注射miR-30b agomir(20 μmol/L，10 μL)，術(shù)后第10天開始注射，連續(xù)注射4 d，1次/d]。分別在術(shù)前1 d，術(shù)后第3、7和14天連續(xù)檢測行為學變化。

1.3 4組大鼠雙側(cè)后肢機械痛敏和熱痛敏的測定

1.3.1 4組大鼠50%縮足閾值(paw withdrawal threshold，PWT)的測定 采用經(jīng)典von-Frey纖維，按Chaplan等[3]報道的方法測定。將大鼠置于金屬網(wǎng)上，蓋以透明的有機玻璃罩，先讓大鼠適應(yīng)環(huán)境20 min, 待大鼠的梳理和探究活動基本消失后，用一系列標準化的von-Frey纖維(0.407, 0.692, 1.202, 2.041, 3.630, 5.495, 8.511, 15.140 g)刺激大鼠后肢足底，直至纖維彎曲成“S”形，持續(xù)5 s，觀察是否出現(xiàn)縮足反應(yīng)。大鼠在刺激時間內(nèi)出現(xiàn)快速的縮足反應(yīng)，記為陽性反應(yīng)，而身體活動所引起的縮足反應(yīng)不記作陽性反應(yīng)。應(yīng)用Dixon[4]報道的方法推算出50% PWT。當50% PWT小于4 g時認為出現(xiàn)機械痛敏。

1.3.2 4組大鼠熱縮足潛伏期(paw withdrawal latency，PWL)的測定 按照Hargreaves 等[5]報道的PWL測定方法，調(diào)整輻射熱的強度，使大鼠PWL基礎(chǔ)值保持在9～12 s，然后設(shè)定輻射光熱測痛儀參數(shù)，設(shè)定熱輻射照射時間極限為20 s。將大鼠置于有機玻璃板上, 蓋以透明的有機玻璃罩, 讓大鼠在透明框中自由活動20 min以適應(yīng)環(huán)境，玻璃板的溫度保持在(26.0±0.5) ℃，調(diào)節(jié)玻璃板下的輻射光源，使其對準大鼠后足掌心部，照射足底，大鼠出現(xiàn)縮足反應(yīng)或照射時間達20 s，光源自動關(guān)閉，并自動記錄時間。正常的大鼠PWL通常為9～14 s。每側(cè)在同一部位測量3次，兩次測量間隔10 min，取平均值。

1.4 4組大鼠脊髓背角組織中Scn3AmRNA和Nav1.3蛋白表達的檢測術(shù)后14 d處死各組大鼠，取大鼠術(shù)側(cè)L4-5脊髓背角組織，分別利用熒光定量PCR和Western blot的方法檢測Scn3A mRNA和Nav1.3蛋白的表達。

1.4.1 Scn3A mRNA表達的熒光定量PCR檢測 Trizol法提取總RNA，利用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶獲得cDNA。使用熒光定量PCR檢測試劑盒[購自天根生化科技(北京)有限公司] 檢測。PCR反應(yīng)條件：預變性50 ℃ 2 min;變性95 ℃ 10 min，退火95 ℃ 15 s，延伸60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。GAPDH為內(nèi)參。采用2-ΔΔCt計算各目的基因的相對表達量。實驗所用基因名稱和引物序列見表1。

表1 基因名稱和引物序列

1.4.2 Nav1.3蛋白表達的Western blot檢測 將組織置于勻漿器中，加入 0.5 mL 細胞裂解液，手動勻漿至組織完全裂解，收集裂解液，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min。BCA 法測蛋白質(zhì)濃度，加入5×蛋白上樣緩沖液，95 ℃加熱10 min使蛋白質(zhì)變性。SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗[兔抗大鼠Nav1.3抗體(按1∶300稀釋，Abcam公司)和β-actin(按1∶1 000稀釋)]孵育，4 ℃過夜，洗膜，加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗(按1∶1 000稀釋， Jackson公司)，室溫孵育2 h，TBST洗膜后加入顯色液，凝膠成像及分析系統(tǒng)中成像。以目的條帶與β-actin的比值，再以假手術(shù)組進行標準化來表示蛋白水平。

1.5統(tǒng)計學處理采用SPSS 20.0進行分析。應(yīng)用單因素方差分析和LSD-t檢驗比較各組細胞中熒光強度、各組大鼠術(shù)側(cè)脊髓背角組織中Scn3A mRNA和Nav1.3蛋白表達的差異，應(yīng)用重復測量數(shù)據(jù)的方差分析比較各組大鼠術(shù)前和術(shù)后不同時間后肢機械痛敏和熱痛敏的差異。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1miR-30b與Scn3A靶標關(guān)系的驗證結(jié)果見表2。由表2可知，共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T Scn3A 3’UTR載體和miR-30b agomir(WT+agomir組)后熒光強度較轉(zhuǎn)染W(wǎng)T+scramble組顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義。而共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T Scn3A 3’UTR載體和miR-30b antagomir對熒光強度無影響。此外，miR-30b agomir對突變體載體熒光強度的表達無影響。

表2 各組細胞中熒光強度的比較 %

*：F=91.840，P<0.001?！鳎号cWT+scramble組相比，P<0.05；#：與Mut+agomir組相比，P<0.05

2.2各組大鼠雙側(cè)后肢機械痛敏和熱痛敏的比較見表3。由表3可知，與假手術(shù)組相比，SNL組和SNL+scramble組的大鼠術(shù)后3、7和14 d術(shù)側(cè)后肢50% PWT均降低，對側(cè)后肢無明顯變化。與SNL+scramble組相比，SNL+agomir組PWT升高，差異有統(tǒng)計學意義，而對側(cè)后肢無明顯變化。SNL組和SNL+scramble組大鼠術(shù)后3、7和14 d術(shù)側(cè)后肢PWL較假手術(shù)組降低，而對側(cè)后肢無變化。注射miR-30b agomir后，SNL大鼠術(shù)側(cè)PWL延長，與注射scramble組相比，差異有統(tǒng)計學意義，而對側(cè)熱痛敏無明顯變化。

表3 各組大鼠后肢機械痛敏和熱痛敏的比較

*：與假手術(shù)組相比，P<0.05；#：與SNL+scramble組相比，P<0.05

2.3各組大鼠脊髓背角組織中Scn3AmRNA和Nav1.3蛋白表達的比較見表4。由表4可知，SNL組和SNL+scramble組大鼠術(shù)側(cè)脊髓背角組織中Scn3A mRNA和Nav1.3蛋白表達較假手術(shù)組增加。相反，在術(shù)后10 d，對SNL大鼠鞘內(nèi)連續(xù)注射miR-30b agomir 4 d后，SNL+agomir組大鼠術(shù)側(cè)脊髓背角組織中Scn3A mRNA和Nav1.3蛋白表達降低，與SNL+scramble組相比，差異有統(tǒng)計學意義；提示SNL誘導的神經(jīng)病理性疼痛可使脊髓背角組織中Nav1.3蛋白表達增加，而過表達miR-30b可降低SNL大鼠脊髓背角組織中Nav1.3蛋白的表達。

表4 各組大鼠術(shù)側(cè)脊髓背角組織中Scn3A mRNA和Nav1.3蛋白的表達

*與假手術(shù)組相比,P<0.05;#:與SNL+scramble組相比,P<0.05

3 討論

神經(jīng)性病理疼痛的發(fā)病機制包括外周神經(jīng)的興奮性增高、中樞敏化、大腦下行易化等幾個方面。脊髓的中樞敏化是其中的重要機制之一，研究其機制對治療神經(jīng)病理性疼痛至關(guān)重要。

脊髓的神經(jīng)元表達多種離子通道蛋白，而離子通道功能的變化與神經(jīng)元的興奮密切相關(guān)，因此，研究在神經(jīng)性病理性疼痛的狀態(tài)下離子通道蛋白的變化對于疼痛機制的研究至關(guān)重要[6]。電壓門控鈉離子通道主要由 α亞基和 β亞基構(gòu)成，其中 α亞基為功能亞單位,是介導鈉離子出入的孔道，與神經(jīng)細胞的興奮性密切相關(guān)?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的功能性電壓門控鈉離子通道包括9種亞型，分別為Nav1.1～Nav1.9；其中Nav1.3在胚胎的神經(jīng)系統(tǒng)廣泛表達，但在成年大鼠的神經(jīng)系統(tǒng)幾乎不表達[7]。盡管在成年大鼠DRG中僅能檢測到少量Nav1.3的表達，但外周神經(jīng)損傷后，其表達在DRG和患側(cè)脊髓背角中均增加[1-2]。Hains等[8]研究顯示在慢性壓迫損傷大鼠神經(jīng)病理性疼痛模型中，脊髓背角Nav1.3 mRNA和蛋白水平表達均上調(diào)，鞘內(nèi)注射Nav1.3反義寡核苷酸可抑制Nav1.3的表達，同時緩解疼痛，這與作者的結(jié)果相一致。雖然已有研究[9]證實Nav1.3在神經(jīng)病理性疼痛模型的脊髓重新高表達與疼痛的發(fā)生密切相關(guān)，但其升高機制并不清楚。本研究試圖通過探索神經(jīng)病理性疼痛發(fā)展階段(7 d以后)脊髓Nav1.3高表達的相關(guān)機制，尋找抑制其高表達的方法，從而探尋對神經(jīng)病理性疼痛治療的新方法。

蛋白表達變化的調(diào)控機制有多種，包括轉(zhuǎn)錄前調(diào)控(如轉(zhuǎn)錄因子的變化、啟動子區(qū)的甲基化調(diào)控等[10])和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控(如內(nèi)源性miRNA的調(diào)控、mRNA的甲基化等[11])。miRNAs是一類具有19～25 個核苷酸的非編碼RNA，其主要作用為轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。miRNA 和靶基因序列的互補程度決定了靶基因mRNA 在翻譯水平被部分抑制或者斷裂降解。當miRNA 與靶mRNA 完全結(jié)合時，靶mRNA 直接被降解；當不完全結(jié)合時，阻遏其翻譯蛋白。這是哺乳動物基因表達在翻譯水平抑制的主要方式。

基于Nav1.3在疼痛中的重要作用及在脊髓高表達的實驗結(jié)果，本實驗試圖尋求能夠調(diào)控Nav1.3的miRNA，探索抑制Nav1.3升高的新方法，為神經(jīng)病理性疼痛的治療提供新的鎮(zhèn)痛靶點和方向。首先作者利用生物信息學軟件TargetScan發(fā)現(xiàn)miR-30b與Scn3A的3’UTR區(qū)序列互補配對，通過構(gòu)建重組與miR-30b互補的Scn3A的3’UTR雙熒光素酶基因報告載體，在細胞水平驗證了miR-30b可直接作用于Scn3A的3’UTR并負調(diào)控Scn3A的表達。為了檢測在體給予miR-30b的鎮(zhèn)痛效果，作者利用大鼠SNL神經(jīng)病理痛模型，通過蛛網(wǎng)膜下隙給予miR-30b的類似物agmir過表達miR-30b，發(fā)現(xiàn)可以逆轉(zhuǎn)脊髓中Nav1.3蛋白高表達，同時SNL模型的神經(jīng)病理性疼痛行為也被反轉(zhuǎn)。

上述實驗驗證了依靠在體轉(zhuǎn)染試劑的幫助，miRNA的確可以轉(zhuǎn)染到在體組織中，并發(fā)揮生物活性。而miRNA-30b抑制神經(jīng)性病理疼痛的機制可能是通過直接作用于編碼Nav1.3 mRNA的3’UTR區(qū)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用，從而抑制Nav1.3的表達所致。因此脊髓水平的Nav1.3有可能作為疼痛治療的靶點，而蛛網(wǎng)膜下隙注射miRNA可望成為治療疼痛的又一個新的手段。