大蒜素后處理對大鼠心肌缺血-再灌注損傷的影響

喬 蕾，武秋林，孔春艷，楊麗娜，劉 芳

河南醫學高等專科學校基礎醫學部生理學教研室 鄭州 451191

近年來，心血管疾病是全球第一大死因[1]。在眾多心血管疾病中，急性心肌梗死死亡率較高。盡早接受冠脈溶栓、介入治療或者冠脈旁路移植手術來實現冠脈血流再通，對恢復心肌血供至關重要。然而隨之而來的心肌缺血-再灌注(ischemia-reperfusion，IR)損傷[2-3]直接影響患者的預后及生存質量，因此，如何減輕IR損傷已成為目前醫學科研工作者研究的熱點。Murry等[4]提出的缺血預處理和藥物預處理均可以有效防治心肌IR損傷，但由于臨床上很難預測急性心肌缺血的時間，因此預處理難于直接用于臨床，故缺血后處理和藥物后處理顯示出強大的臨床應用價值[5]。藥物后處理在再灌注早期以藥物替代缺血刺激，有利于保護血管，實施方便，劑量易于控制。

大蒜素是一種含硫化合物，其化學名稱為二烯丙基三硫化物，目前有不少文獻報道大蒜素可以防治心血管疾病、抑制腫瘤生長、抗微生物活性、延緩心肌細胞凋亡、調節血脂水平、提高機體免疫力[6-11]等。已有實驗[12-13]證實大蒜素預處理能夠保護IR損傷的心肌，但是，有關大蒜素后處理對IR損傷心肌作用的報道較少。本實驗通過Langendorff離體心臟灌流技術制備IR損傷模型，觀察再灌注早期給予大蒜素處理對IR心肌的影響，為臨床應用提供依據。

1 材料與方法

1.1實驗動物及主要試劑、儀器雄性Wistar大鼠24只，體重(300±30) g，購于河南省實驗動物中心，合格證號：SCXK(豫)2010-0002。大蒜提取物購自遠誠化工有限公司。SOD、MDA和LDH檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。GL1003型Langendorff恒壓灌流裝置購自成都泰盟科技有限公司。RM6240B型多道生理信號采集處理系統購自成都儀器廠。

1.2大鼠離體心臟IR損傷模型的制備大鼠腹腔注射肝素500 IU/kg抗凝，給予氨基甲酸乙酯1 g/kg麻醉，麻醉后迅速打開胸腔及心包，剪斷大血管并使主動脈斷端保留5～8 mm。快速取出心臟，置于預先氧飽和的冰水混合物狀態的K-H液中，使心臟停搏，排出心腔內殘余血液，在液面下將 Langendorff 灌注管口逆行插入主動脈，迅速將心臟懸掛在離體灌流系統上，整個過程在2 min內完成。然后使用 37 ℃恒溫加熱的體積分數為95% O2和 5%CO2混合氣體飽和的K-H 液進行常規恒壓(70～80 mmHg，1 mmHg=0.133 kPa)恒流(8～10 mL/min)灌注。K-H液成分：NaCl 118.3 mmol/L，NaHCO325 mmol/L, KCl 4.7 mmol/L, MgSO4·7H2O 1.2 mmol/L，KH2PO41.2 mmol/L， CaCl21.8 mmol/L，葡萄糖11.1 mmol/L；實驗前配制備用，調節pH值7.3～7.4。待心律穩定后，在左心房側壁剪一小口，將一帶有小乳膠水囊的測壓管經二尖瓣口插入左心室，連接壓力換能器，調節左心室內水囊的容積，使左心室舒張末期壓(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)為4～10 mmHg，記錄左室內壓波形的變化[14]。穩定20 min(平衡灌注)后，關閉灌注裝置30 min(缺血)，再開通灌注裝置60 min(再灌注)。

1.3實驗分組動物隨機分為4組，每組6只，均按1.2法制備離體心肌IR損傷模型。IR組：平衡灌注20 min缺血30 min，用K-H液再灌注60 min。LA、MA、HA組：平衡灌注20 min缺血30 min，再灌注時先分別給予5、10、20 μmol/L大蒜素灌注液灌流20 min，然后再用K-H液灌注，共持續灌流60 min[15]。

1.4心功能參數的測定采用RM6240B型多道生理信號采集處理系統，記錄平衡灌注末和再灌注時的心功能參數，包括心率(HR)、左室內壓上升最大速率(+LVdP/dtmax)、左室內壓下降最大速率(-LVdP/dtmax)、左心室發展壓(LVDP)以及冠脈流量(CF)。

1.5心臟灌流液中LDH活性的測定再灌注末，分別留取心臟漏出液1.5 mL，放入-70 ℃冰箱保存備用。將留存的心臟漏出液取出，室溫下自然融化，按試劑盒說明書操作，檢測LDH活性[15]。

1.6心肌組織中SOD活性和MDA含量的測定再灌注末取下心臟，迅速剪下缺血區心肌組織約0.1 g，置于冰冷生理鹽水中漂洗，用濾紙吸干，放入1.5 mL塑料離心管中，經液氮冷凍后置-70 ℃冰箱中保存。實驗全部結束后，將標本取出，制備上清液，嚴格按照試劑盒說明書測定SOD活性、MDA含量[15]。

1.7統計學處理應用SPSS 19.0處理數據，4組各指標的比較采用重復測量數據的方差分析，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 4組心功能參數的比較見表1。平衡灌注末4組HR、CF、+LVdP/dtmax、-LVdP/dtmax和LVDP差異均無統計學意義，表明實驗模型穩定可靠。與IR組比較，LA、MA和HA組HR降低，CF、LVDP、+LVdP/dtmax、-LVdP/dtmax均提高； MA組的改善最明顯。

表1 4組心功能參數的比較(n=6)

2.2 4組心肌生化指標的比較見表2。與IR組相比，再灌注末LA、MA和HA組心臟漏出液中LDH活性降低，心肌組織中SOD活性提高，MDA含量降低；MA組的變化最明顯。

表2 4組大鼠再灌注末心肌相關生化指標的比較

*：與IR組比較，P<0.05

3 討論

大蒜素作為一種天然植物提取物，具有殺菌消炎、抑制腫瘤、降低血脂、減少血小板聚集、改善心血管彈性等功效[16]。近年來,大蒜素在防治心血管疾病領域的作用日漸受到重視。史春志等[17]發現大蒜素可延緩心肌細胞凋亡，提高心肌細胞的缺氧耐受性，促進受損心肌細胞的自我修復。李格等[18]實驗證實，大蒜素可提高心肌組織中SOD和全血谷胱甘肽過氧化物酶活性，降低血漿內皮素水平。上述研究結果提示大蒜素可通過減少氧自由基生成，發揮保護血管內皮細胞的作用。

本研究結果顯示，大蒜素后處理可提高大鼠IR損傷心肌的LVDP、+LVdP/dtmax、-LVdP/dtmax，增加CF，降低心臟漏出液中LDH活性，提高心肌組織中SOD活性，降低MDA含量；MA組改善效果最佳。LVDP是心肌收縮時左心室內壓上升的幅度，可反映心肌收縮力的強弱;+LVdP/dtmax是心肌收縮時左心室內壓上升的最大速度，可反映心肌興奮-收縮耦聯期間肌漿中Ca2+的水平、心肌收縮功能狀態以及心室各部分收縮協調能力；-LVdP/dtmax是心肌舒張時心室內壓下降的最大速度，反映左心室的舒張功能[15]。研究結果提示在一定劑量范圍內，大蒜素后處理對于IR損傷心肌具有較好的保護作用，在灌注濃度為10 μmol/L時保護作用最佳，與廖奕華等[19]的研究結果一致。本研究結果與趙文萃等[20]的研究略有差異，可能與動物的差異及大蒜素劑量的不同有關。

該研究也觀察到，低濃度的大蒜素后處理可輕度減慢離體心臟的竇性心律；隨著大蒜素濃度的增加，中等濃度可顯著抑制離體心臟的竇性心律并減慢房室傳導，但當大蒜素濃度達到較高水平時,其對竇性心律、房室傳導的抑制作用減弱。由于離體實驗能排除神經體液因素的影響,因此,大蒜素具有抑制竇性心律的作用得到了進一步的證實。本研究結果與程偉等[21]的結果相符，他們觀察到大蒜素能降低豚鼠心肌自律性和興奮性，延長有效不應期，并推測大蒜素可能通過減低慢反應細胞動作電位0期最大上升速率和幅度以及舒張期去極化速率，從而減慢房室交界區傳導速度，降低自律性[22]，因而可用于以快速心率為基礎的心律失常，如早搏、心動過速等的輔助療法。

有研究[12]顯示，大蒜素對于 p38MAPK的磷酸化具有一定的積極作用。p38MAPK信號通路是近年來研究較多的信號通路之一，其在細胞凋亡中發揮調控作用，其上游信號通路中存在 PKC-TGF-β1-p38MAPK 的激活機制。大蒜素可能會引起細胞中蛋白激酶C(PKC) 通路的活化[23]。總之，本實驗證實了大蒜素后處理可增強心肌的抗氧化能力，從而減輕離體心肌IR損傷，發揮心肌保護作用，其適宜濃度為10 μmol/L，其對IR損傷心肌的保護機制值得進一步探討。