河南省首例輸入性諾氏瘧的診斷和分析

周瑞敏，李素華，高麗君，錢 丹，楊成運，劉 穎，趙玉玲，張紅衛

河南省疾病預防控制中心；河南省傳染病病原生物重點實驗室 鄭州450016

諾氏瘧原蟲(Plasmodiumknowlesi)在自然界中主要寄生于獼猴體內，20世紀30年代早期，印度加爾各答熱帶醫學院首次發現并對其進行了研究，其可通過血液傳染給人類[1-3]。1954年，Chin等[4]報道了第一例人類自然感染諾氏瘧原蟲病例，為美國陸軍的一名調查員在馬來西亞森林中工作時感染。人類自然感染諾氏瘧原蟲一直被認為非常少見，直到2004年Singh等[5]應用分子生物學技術對馬來西亞婆羅洲鏡檢陽性的瘧疾病例進行檢測，發現許多患者為諾氏瘧原蟲感染，證實了人類自然感染諾氏瘧原蟲的普遍存在。此后，幾乎東南亞所有國家都有人類自然感染諾氏瘧原蟲的報道，諾氏瘧原蟲亦被認為是感染人類的第五種瘧原蟲[6-8]。

我國曾有多位學者報道過非典型形態的間日瘧原蟲感染，如間日瘧原蟲多核亞種，但缺乏分子生物學證據[9]。2006年，朱淮民等[10-11]對云南省墨江縣1998年緬甸輸入的“間日瘧原蟲和惡性瘧原蟲混合感染”患者血涂片進行回顧性復查，發現其形態特異，經分子生物學技術檢測確診為諾氏瘧原蟲感染。2014年10月，潘波等[12]報道了廣東省首例輸入性諾氏瘧原蟲感染病例，患者從馬來西亞旅游回國。2017年10月，河南省確診省內首例輸入性諾氏瘧原蟲感染病例，也為我國第三例輸入性諾氏瘧原蟲感染病例，現報道如下。

1 材料與方法

1.1樣本來源由河南省瘧疾診斷參比實驗室收集瘧疾患者的樣本進行實驗室復核，主要包括有厚、薄血膜的血涂片和治療前采集的EDTA抗凝血，血涂片室溫保存，血液樣本-80 ℃保存。樣本的采集和流行病學調查均獲得了患者的知情同意。

1.2瘧原蟲檢測血涂片的制作和瘧原蟲檢測方法參照《瘧疾的診斷》標準(WS 259-2015)。檢測厚血膜確定為瘧原蟲陽性后，通過薄血膜上蟲體形態確定蟲種。

1.3瘧原蟲抗原檢測采用快速診斷實驗(rapid diagnostic test, RDT)進行抗原檢測。萬孚瘧原蟲快速檢測試劑盒和CareStartTM瘧原蟲快速檢測試劑盒分別購自廣州萬孚生物技術股份有限公司和美國Access Bio公司。按照試劑盒使用說明書對EDTA抗凝血樣進行檢測。

1.4瘧原蟲18SrRNA的檢測及序列分析采用巢式PCR法檢測。核酸提取試劑盒購自德國Qiagen公司，PCR 反應預混液購自美國Promega公司，核酸電泳DNA標志物購自生工生物工程(上海)股份有限公司，Gold view核酸染料購自北京賽百盛基因技術有限公司，瓊脂糖為西班牙Biowest公司產品。從血液樣本中提取瘧原蟲基因組DNA，-20 ℃保存備用。按照參考文獻[4]合成針對瘧原蟲18S rRNA的引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。采用屬特異性引物rPLU1和rPLU5進行第一輪PCR擴增，反應體系為：2×PCR 預混液 10 μL，上、下游引物(10 mol/μL)各0.6 μL，模板DNA 2 μL，用ddH2O補至20 μL。反應條件：94 ℃5 min；94 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃60 s，共35個循環；72 ℃5 min。將第一輪PCR產物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，采用ChromasPro軟件將序列進行拼接，將所得序列在GenBank數據庫中通過BLAST進行同源性比較。采用蟲種特異性引物進行第二輪PCR擴增，引物分別為間日瘧原蟲rV1V1和rV1V2、惡性瘧原蟲rFAL1和rFAL2、三日瘧原蟲rMAL1和rMAL2、卵形瘧原蟲rOVA1和rOVA2、諾氏瘧原蟲Pmk8和Pmkr9，以第一輪產物為模板，反應體系同第一輪，反應條件同第一輪但退火溫度改為58 ℃。PCR產物經20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，通過凝膠成像系統觀察結果。

1.5診斷與治療按照我國現行《瘧疾的診斷》標準(WS 259-2015)進行診斷。結合2015年世界衛生組織推薦的《抗瘧藥物使用指南》(第三版)和我國《抗瘧藥物使用規范》(WS/T 485-2016)對患者進行正規治療：給予磷酸氯喹和磷酸伯氨喹8 d療法，服藥后1周再口服雙氫青蒿素磷酸哌喹片。

2 結果

2.1患者基本情況周某，男，51歲，河南省信陽市羅山縣人，于2017年3月到印度尼西亞從事木材加工工作，工作地點位于森林附近，自述經常能見到猴子(具體品種不詳)出沒，但無近距離接觸。患者2017年9月11日回國，19日出現發熱癥狀，每天夜間發作，體溫最高達39.8 ℃，伴有出汗和畏寒，無其他不適癥狀，在本村診所按照感冒治療數日后未見好轉，經另外一名鄉村醫生建議到該縣疾病預防控制中心進行瘧原蟲檢查。采集末梢靜脈血制作血涂片，吉姆薩染色后鏡檢發現瘧原蟲，診斷為三日瘧原蟲感染。患者血液樣本送至河南省疾病預防控制中心瘧疾診斷參比實驗室進行鏡檢、RDT和PCR復核，確診為諾氏瘧原蟲感染。患者曾于2014年7月至2016年1月在埃塞俄比亞務工，但否認期間有瘧疾史；在印度尼西亞務工期間亦未患瘧疾；近期無輸血史。

2.2實驗室檢測

2.2.1 鏡檢結果 見圖1。薄血膜中，被諾氏瘧原蟲寄生的紅細胞不脹大，早期滋養體的形態特征與惡性瘧原蟲相似，蟲體較小，具有雙核和一個紅細胞多個瘧原蟲寄生；其他階段的形態特征則和三日瘧原蟲相似，瘧色素出現較早，呈黑褐色，顆粒粗大，與細胞質交織在一起；晚期滋養體有成帶狀發展趨勢或形成阿米巴樣。厚血膜中，早期滋養體形態與惡性瘧原蟲相似，而其他階段形態與三日瘧原蟲相似。故通過鏡檢很難準確識別諾氏瘧原蟲的形態。

A～C：薄血膜；D～E：厚血膜圖1 血涂片中諾氏瘧原蟲形態(×1 000)

2.2.2 RDT 瘧原蟲抗原檢測結果均為陰性。

2.2.3 瘧原蟲18S rRNA的檢測 第一輪PCR產物長度約為1 600 bp，同源性比對結果顯示與GenBank中諾氏瘧原蟲18S rRNA部分基因序列(GenBank登錄號為DQ350266.1、L07560.1和AY327554.1)的一致性達99%。所得序列已提交GenBank(登錄號為MG570077)。采用諾氏瘧原蟲蟲種特異性引物Pmk8和Pmkr9進行第二輪擴增，在152 bp位置處有一特異性擴增條帶，與預期大小一致；而采用其他4種瘧原蟲蟲種特異性引物未擴增出目的條帶(圖2)。

1、4、7、10、13：患者樣本；2、5、8、11：分別為間日瘧原蟲、惡性瘧原蟲、三日瘧原蟲和卵形瘧原蟲陽性對照；3、6、9、12、14：陰性對照；M：DNA標志物

圖2巢式PCR

2.3診斷與治療結合患者臨床表現、流行病學史和實驗室檢查結果，確診為境外輸入性諾氏瘧原蟲感染病例。治療后經血涂片鏡檢未發現瘧原蟲。1個月后電話回訪，未發現異常。

3 討論

1932年，諾氏瘧原蟲被發現并命名后，Knowlesi和Gupta[1]對其進行了更深入的研究，通過人體實驗觀察到3名感染諾氏瘧原蟲的患者呈現每天發熱的周期性。本研究中該患者每天夜間發熱，伴有出汗和畏寒，有諾氏瘧原蟲感染的典型臨床表現，同時該患者在森林附近工作，具有流行病學史，懷疑為自然感染的諾氏瘧原蟲病例，需進一步通過實驗室檢測確診。

鏡檢作為瘧原蟲檢測的金標準被廣泛應用，但也常常因血涂片制作染色差、原蟲密度低、蟲體變形或形態的相似性等原因發生誤診或漏診。該患者最初被診斷為三日瘧，經形態學觀察，早期滋養體的形特征與惡性瘧原蟲相似，其他階段的形態特征則和三日瘧原蟲相似。1932年，Knowlesi和Gupta[1]首次提出了諾氏瘧原蟲和三日瘧原蟲在形態上有相似性。Cox-Singh等[13]讓12家醫院的鏡檢專家對349份確診的諾氏瘧原蟲感染樣本進行鏡檢，91%的樣本被診斷為三日瘧原蟲，剩余樣本則被診斷為間日瘧原蟲和惡性瘧原蟲。故通過形態學檢測很難確診諾氏瘧原蟲感染。萬孚和CareStartTM瘧原蟲快速檢測試劑盒含有瘧原蟲乳酸脫氫酶(plasmodium lactate dehydrogenase, panLDH)抗體，為“泛瘧疾抗體”，主要用于檢測感染人類的4種常見瘧原蟲的抗原。諾氏瘧原蟲導致人類感染瘧疾的重要性未引起足夠的重視，目前所有商品化的瘧原蟲快速檢測試劑盒均不能用于諾氏瘧原蟲的檢測[14]，本研究中兩種試劑盒的RDT結果均為陰性。

與鏡檢相比，分子生物學方法對瘧原蟲檢測的敏感性和特異性更高[15-19]。本研究中，利用巢式PCR方法，通過諾氏瘧原蟲蟲種特異性引物Pmk8和Pmkr9，從患者血樣擴增出了預期的目的條帶，序列分析進一步證實為諾氏瘧原蟲感染。

本研究充分分析了患者的流行病學史和臨床表現，結合實驗室檢測結果，最終確診為輸入性諾氏瘧原蟲感染。目前，我國暫無針對諾氏瘧原蟲感染的抗瘧藥物使用規范，參考2015年世界衛生組織發布的《抗瘧藥物使用指南》(第三版)，結合我國《抗瘧藥物使用規范》(WS/T 485-2016)的用藥標準，對患者進行磷酸氯喹和磷酸伯氨喹8 d療法，服藥后1周再口服雙氫青蒿素磷酸哌喹片，患者痊愈。我國廣東輸入性諾氏瘧原蟲感染病例同樣采用了該方案治療[12]。此外，東南亞等國家和地區采用類似的治療方法也治愈了許多諾氏瘧原蟲感染患者[20]。本研究再次證實以青蒿素為基礎的聯合治療方法對治療諾氏瘧原蟲感染是安全、有效、可行的。

人類自然感染諾氏瘧原蟲輸入病例對我國瘧疾防治工作提出了新的挑戰，需要及時更新針對諾氏瘧原蟲感染的診斷、治療和防控等相關知識，同時提高臨床醫生和瘧疾防治專業人員對諾氏瘧原蟲感染的認識和診治水平，為我國2020年實現消除瘧疾的目標提供保障。