miR-499-5p干預對心肌梗死大鼠心肌細胞凋亡的影響

吳麗夢，李 恩，周小翠，郭小宏，王 蒙，趙英杰，汪 濤

1)鄭州大學第二附屬醫院心血管內科 鄭州 450014 2)鄭州大學第二附屬醫院老年醫學科 鄭州 450014

心肌梗死由心肌組織長時間缺血引起，病理過程涉及梗死早期炎癥反應、心肌細胞凋亡以及梗死后期心臟重塑如心肌肥厚、心肌纖維化。心肌梗死仍然是世界范圍內的主要死因[1]。

微小核糖核苷酸(miRNAs)是一類長度為20～25個核苷酸的非編碼型RNA，與靶基因mRNA 3’非編碼區域(3’UTR)結合，下調mRNA翻譯或促進mRNA降解從而負性調控靶基因表達[2-3]。近來研究[4-6]表明急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)發生后體內多種miRNAs表達異常，包括miR-1、miR-133、miR-208、miR-499-5p等心臟特異性miRNA。AMI后兩個關鍵事件為心肌細胞凋亡和細胞壞死。有研究[7-9]發現存在多種miRNAs調節心肌細胞凋亡,其中miR-499-5p在心肌細胞氧化應激損傷中發揮抗心肌細胞凋亡作用。但目前關于其在心肌梗死后心肌細胞凋亡中的作用及機制仍不清楚。本研究中作者觀察了心肌梗死大鼠梗死心肌組織miR-499-5p表達量的改變，探討miR-499-5p在大鼠心肌梗死后心肌細胞凋亡中的作用和相關機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物、細胞及藥品試劑、儀器成年雄性SD大鼠，體重200～250 g，8～10周齡，購自鄭州大學實驗動物中心。大鼠在(25±2) ℃的環境溫度下飼養, 光照條件12 h/12 h。建模前飼養1周使其適應環境,所有動物實驗均遵守《實驗動物管理條例》并遵循動物倫理學要求。HEK293細胞購于中科院上海細胞庫。miR-499-5p mimics及競爭性短核糖核苷酸陰性對照序列(scramble-NC)購自廣州銳博公司，miR-499-5p特異性引物、Lipofectamine2000、組織RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒購自Invitrogen公司，pcDNA3.1-Sox6(上海吉瑪基因公司)，Sox6、Bax及Bcl-xl一抗(Abcam公司，香港)，GAPDH抗體、二抗(Sigma公司)。小動物超聲儀(FUJIFILM Visual Sonics公司), DW3000-B型小動物呼吸機(北京眾實迪創科技發展有限責任公司),心電圖機(中國成都, RM6240多導生理信號采集處理系統)。

1.2AMI模型的建立大鼠腹腔注射100 g/L水合氯醛(3 mL/kg)麻醉,取仰臥位并固定于手術臺上，參考文獻[10]的方法，在左側第3、4肋間隙開胸后暴露心臟，打開心包膜。在左心耳根部下方3 mm處進針，肺動脈圓錐邊緣出針，用5-0縫合線結扎左冠脈前降支(LAD)，結扎部位以下心室肌顏色發紺或者顏色發白、心室壁運動減弱，心電圖Ⅱ導聯T波高尖、S-T段呈持續弓背向上抬高，表明模型制作成功，記錄結扎時間。

1.3qRT-PCR檢測梗死區和非梗死區心肌miR-499-5p表達取18只大鼠，按1.2方法處理，分別于LAD結扎1、6、48 h處死6只大鼠，分離左室前壁梗死心肌與非梗死心肌，應用Trizol試劑盒提取心肌組織總RNA，反轉錄為cDNA；參照操作說明，應用特異性引物、SYBR熒光試劑盒、Taqman試劑盒在PRISM 7900HT檢測系統(Applied Biosystems)中完成qPCR。miR-499-5p上游引物：5’-GGGGTTA AGACTTGCAGTG-3’，下游引物：5’-CAGTGCGT GTCGTGGAGT-3’；U6：上游引物：5’-CTCGCTTCG GCAGCACA-3’，下游引物：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。反應體系(總體積25 μL)：cDNA 2.5 U,上、下游引物各1 μL, SYBR GreenⅠ PCR master Mix 12.5 U,DEPC水8 μL。反應條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，循環40次。根據2-ΔΔCt法計算miR-499-5p的表達水平，U6為內參。

1.4實驗分組大鼠隨機分成假手術組、AMI組、AMI+scramble-NC組(陰性對照組)、AMI+miR-499-5p mimics組(干預組)，每組12只。除假手術組外，其余3組大鼠均制作AMI模型。假手術組除不結扎LAD外，其他操作與其他3組相同。陰性對照組、干預組在有效結扎LAD后，參照商家說明書和參考文獻[10]，用胰島素筆將20 μL的scramble-NC或miR-499-5p mimics與Lipofectamine2000混合液(體積比1∶1)注射到結扎部位以下左室前壁心肌內，之后逐層縫合關胸。術后連續3 d給予青霉素(20萬U/只)抗感染治療。

1.5心肌細胞凋亡率測定術后48 h，取4組大鼠梗死區域心肌組織，洗凈后置于40 g/L多聚甲醛中固定1 d，常規石蠟包埋后切片，按照TUNEL試劑盒說明書行切片染色后拍照。每張切片選取10個區域計數凋亡細胞(細胞核棕染)，凋亡率=凋亡細胞數/總細胞數×100%。

1.6Sox6及凋亡相關蛋白表達的檢測術后48 h，取4組大鼠梗死區域心肌組織，檢測 Sox6 mRNA和蛋白，以及凋亡蛋白 Bax、抗凋亡蛋白 Bcl-xl 的表達。qRT-PCR檢測梗死區域心肌組織Sox6 mRNA的表達。Sox6上游引物序列：5’-CCCCTCTGAACATGGTGGTGGC-3’，下游引物序列：5’-TGAGACTGCCCCTGCCGAGT-3’。Western blot檢測蛋白表達：應用RIPA組織裂解液提取樣本總蛋白。BCA法檢測蛋白濃度。上樣量20 μg，80 g/L SDS PAGE電泳分離蛋白后轉至PVDF膜, 50 g/L脫脂牛奶封閉2 h后加特異性一抗(Sox6、Bax及Bcl-xl一抗均按1∶1 000稀釋)，4 ℃下孵育過夜，PBS-T液洗膜后用辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗(按1∶500稀釋)室溫孵育2 h后曝光；用Image J軟件分析條帶灰度值，以目標條帶和GAPDH條帶灰度值的比值作為目標蛋白的相對表達量。

1.7大鼠心臟超聲評估心功能術后第28天，4組各取6只大鼠，麻醉后采用小動物超聲儀探頭(型號：Veno2100)于胸骨旁左室長軸切面檢測M超圖像，測定左室收縮末期直徑、左室舒張末期直徑，計算左室射血分數(EF)和左室短軸縮短率(FS)。

1.8Sox6與miR-499-5p靶向關系的確定經TargetScan Human、miRDB網站預測Sox6是miR-499-5p最可能的靶基因；經PCR擴增獲得野生型Sox6 3’UTR基因；應用點突變試劑盒使Sox6 3’UTR種子序列GUCUUAA(120～126)突變為GUCCUAA，獲得突變型Sox6 3’UTR基因。隨之將野生型、突變型Sox6 3’UTR基因片段克隆到熒光素酶報告載體中形成熒光素酶報告質粒。將HEK293細胞以1×105個/孔的密度鋪于6孔板，應用Lipofectamine2000、500 μg Sox6 3’UTR或Sox6 3’UTR-突變型質粒與miR-499-5p mimics或陰性對照序列共轉染HEK293細胞；轉染18 h后轉移至96孔板,培養24 h后收集細胞檢測熒光素酶活性，以螢火蟲熒光素酶基因作為報告基因，以海腎熒光素酶基因作為對照基因進行標準化。

1.9統計學處理應用SPSS 21.0處理數據。采用配對t檢驗比較不同時間點梗死區域和非梗死區域心肌組織miR-499-5p的表達，采用單因素方差分析比較4組大鼠心肌細胞凋亡率、EF值、FS值，Sox6 mRNA，Sox6、Bax、Bcl-xl 蛋白的表達及4組HEK293細胞熒光素酶基因的表達，兩兩比較采用LSD-t法。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1梗死區域心肌組織miR-499-5p的表達LAD結扎1、6、48 h，大鼠梗死區域心肌組織miR-499-5p的表達量較非梗死區域下降，見表1。

表1 梗死區和非梗死區心肌miR-499-5p的表達

2.2 4組大鼠心肌細胞凋亡率及心功能指標比較

4組大鼠心肌切片TUNEL染色結果見圖1。4組大鼠典型心臟M超見圖2。心肌梗死第28天大鼠心臟標本梗死部位以下可見明顯心肌瘢痕組織。與陰性對照組和AMI組比較，干預組心肌細胞凋亡率降低，EF值、FS值升高，結果見表2。

A、B、C、D：分別為假手術組、AMI組、陰性對照組和干預組圖1 各組典型TUNEL染色結果 (×400)

圖2 4組大鼠典型M超圖像表2 4組凋亡率、EF、FS的比較

%

#：與假手術組相比，P<0.05；*：與其他3組相比，P<0.05

2.3 4組大鼠梗死區心肌組織Sox6mRNA和凋亡相關蛋白的表達見圖3、表3。與假手術組相比，AMI 組Sox6 mRNA，Sox6、Bax蛋白表達均增高，Bcl-xl 蛋白表達降低；與 AMI 組和陰性對照組相比， 干預組 Sox6 mRNA，Sox6、Bax蛋白表達降低，Bcl-xl 蛋白表達升高。

2.4miR-499-5p與Sox6的靶向關系miR-499-5p 與 Sox6 3’UTR 第 120～126 位堿基序列結合位點見圖4。熒光素酶報告實驗結果：陰性對照+野生型質粒組、miR-499-5p mimics+野生型質粒組、陰性對照+突變型質粒組、miR-499-5p mimics+突變型質粒組熒光素酶活性分別為(0.997±0.087)、(0.490±0.070)、(1.006±0.094)和(0.997±0.081)(F=51.161，P=0.006); 與其他3組相比，miR-499-5p mimics+野生型質粒組熒光素酶活性降

低(P<0.01)，提示miR-499-5p 特異性調控Sox6 3’UTR。

1～4：分別為假手術組、AMI組、陰性對照組和干預組圖3 4組大鼠梗死區心肌組織Sox6和相關凋亡蛋白的表達表3 4組大鼠梗死區心肌組織Sox6和相關凋亡蛋白的表達

組別nSox6 mRNASox6蛋白Bax蛋白Bcl-xl蛋白假手術組31.121±0.1430.372±0.0390.267±0.0510.973±0.138AMI組38.397±0.557#1.077±0.152#0.713±0.045#0.383±0.042#陰性對照組38.369±0.8031.012±0.1390.770±0.0360.360±0.040干預組34.235±0.281*0.683±0.090*0.573±0.035*0.787±0.040*F141.88024.41684.49846.016P<0.0010.040<0.0010.027

#：與假手術組相比，P<0.05；*：與其他3組相比，P<0.05

圖4 miR-499-5p 與 Sox6 3’UTR 的結合位點

3 討論

miR-499-5p是進化上高度保守的肌肉特異性microRNA，在心室中高度表達[11-12]。體內、體外實驗均有研究[13-16]表明在缺血、缺氧或氧化應激等因素刺激下，心肌組織或細胞miR-499表達水平改變，但結論不一致。Li等[13]發現心肌細胞缺氧后miR-499水平降低，miR-499過表達可抵抗心肌細胞缺氧性損害；而Wang等[14]在H2O2所致心肌細胞氧化應激損傷模型中發現miR-499水平改變與H2O2劑量相關，低劑量H2O2致miR-499水平升高，相對高劑量H2O2致miR-499水平降低；Matkovich及Shieh等[15-16]發現miR-499在患心肌病的人群或心肌肥厚大鼠的心肌組織中表達增加，且足以引起心力衰竭。可見不同因素刺激所致損傷心肌組織或細胞miR-499表達水平各異，而且關于miR-499-5p的效應目前的研究結論不一致，有的報道為心臟保護性作用，有的證實為損害性效應；本實驗的意義在于首次探究miR-499-5p在大鼠心肌梗死后的作用和可能的分子機制。

我們的前期實驗證實大鼠冠脈結扎1、6、48 h后梗死區域心肌miR-499-5p表達均低于非梗死區，提示miR-499-5p可能參與心肌梗死后心肌組織的病理過程。進一步分組觀察結果表明，與假手術組比較，AMI組心肌細胞凋亡率增加，術后第28天心臟EF值、FS值降低，心功能下降；而與陰性對照組、AMI組相比，干預組心肌細胞凋亡率降低，術后第28天心臟EF值、FS值升高，心功能改善，證實miR-499-5p干預可對梗死心肌發揮保護作用。

特定miRNA可調控多種mRNA表達和功能，且某一種mRNA亦可被多種miRNAs調節[17-18]。有報道[12-14]miR-499-5p在抗心肌細胞凋亡作用中的靶基因可能為PDCD4、鈣調磷酸酶和發動蛋白相關蛋白-1等；崔瑞新等[19]發現miR-499可能通過增加PI3K mRNA表達水平和Akt磷酸化來發揮抗缺血-再灌注心肌損傷作用。Sox6基因在細胞死亡、分化和增殖中起關鍵作用，在不同人類惡性腫瘤中為抑癌基因；Sox6作為促凋亡因子，調節心肌細胞凋亡[7，20]。我們首先應用靶基因預測軟件推斷Sox6為miR-499-5p可能的靶基因，之后應用雙熒光素酶報告實驗發現當細胞共轉染 miR-499-5p 和野生型 Sox6 3’UTR 報告質粒時，熒光素酶活性被抑制；此外，Western blot結果表明，上調梗死心肌miR-499-5p的表達可使Sox6在mRNA和蛋白水平表達均降低，證實Sox6為miR-499-5p的靶基因。

此外，與陰性對照組和AMI組比較，miR-499-5p干預后梗死心肌Bax蛋白表達降低，Bcl-xl蛋白表達升高。BCL-2家族包括抗凋亡、促凋亡成員，可作為某些凋亡介質的下游關鍵因子[21-22]，結合Sox6為促凋亡因子，我們設想BCL-2家族中Bax、Bcl-xl很可能為凋亡通路中Sox6下游因子，但尚缺乏細胞實驗或者轉基因動物實驗來證實該推測。另外本研究僅在動物水平證實miR-499-5p在心肌梗死后的抗心肌細胞凋亡作用，凋亡相關指標檢測較少，并且尚未在細胞水平上探索miR-499-5p對缺氧心肌細胞的作用，因此本研究存在一些局限性。

綜上所述，我們的實驗結果初步證實了miR-499-5p具有抗心肌細胞凋亡的作用，“miR-499-5p/Sox6/Bax,Bcl-xl”可能為調節凋亡的通路，為探索治療心肌梗死的新策略提供了初步依據。