miRNA-223-3p調(diào)控JAK2/STAT3信號(hào)通路對胃癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移的影響

謝 瓊，胡桂明，王洪濤

1)鄭州市婦幼保健院超聲科 鄭州 450012 2)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科 鄭州 450014 3)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科 鄭州 450052

胃癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，具有早期易轉(zhuǎn)移、晚期難治療、預(yù)后差等特點(diǎn)[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)[2]，我國胃癌的病死率呈整體上升趨勢。針對目前的形勢，尋找治療的方法及腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行早期診斷是解決問題的關(guān)鍵。miRNA是一類長度為20～25個(gè)核苷酸的小分子非編碼RNA，其可通過與靶基因結(jié)合使靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯受到抑制而發(fā)揮生物學(xué)作用[3]。有研究[4-5]顯示，miRNA參與細(xì)胞的增殖、凋亡等過程，在胃癌等多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)異常。 miRNA-223-3p在胃癌組織及MKN-28細(xì)胞高表達(dá)，參與胃癌的發(fā)生，但具體機(jī)制尚不完全清楚[6]。JAK/STAT信號(hào)通路參與細(xì)胞增殖、凋亡、分化等多種生命活動(dòng)過程，JAK2作為上游激酶活化后募集胞漿中的STAT3單體，使無活性的STAT3形成有活性的二聚體，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核與DNA集合，從而導(dǎo)致靶基因的開啟[6-8]。近些年來發(fā)現(xiàn)JAK2/STAT3的激活參與了腫瘤的發(fā)生及發(fā)展[9]。鑒于此，本研究觀察了miRNA-223-3p是否可調(diào)節(jié)JAK2/STAT3信號(hào)通路影響胃癌的發(fā)生及轉(zhuǎn)移，以期為今后研究及臨床提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 組織和細(xì)胞 40份胃癌組織及相應(yīng)的癌旁組織為鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院手術(shù)切除凍存標(biāo)本，其中男26例，女14例，中位年齡56歲。人胃癌細(xì)胞株MKN-28由鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供。

1.1.2 試劑和儀器 FBS、胰蛋白酶、青鏈霉素、RPMI 1640培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司；CCK8細(xì)胞增殖試劑盒購自北京莊盟有限公司；Annexin V-FITC凋亡試劑盒購自美國BD公司；Bcl-2、Bax、Cleaved-Caspase3、JAK2、STAT3、p-STAT3單克隆抗體及辣根過氧化物標(biāo)記的二抗均購自美國Abcam公司；PCR儀購自美國Bio-Rad公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國西盟公司；酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad公司；倒置熒光顯微鏡購自日本Nikon公司；流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)取保存于液氮罐中的胃癌細(xì)胞株MKN-28，37 ℃水浴鍋快速解凍后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，加入含有體積分?jǐn)?shù)10% FBS、100 mg/L鏈霉素和100 U/mL青霉素的RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基，1 000 r/min離心5 min，去除上清，加入細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，并接種于細(xì)胞培養(yǎng)板，置于溫度37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后換液一次，之后每2～3 d換液一次，細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代。

1.3胃癌和癌旁組織中miRNA-223-3p表達(dá)的RT-PCR檢測Trizol法提取40份胃癌組織和癌旁組織中的總RNA，以紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的RNA質(zhì)量。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照PCR試劑盒操作說明進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增。以U6作為內(nèi)參，按照2-ΔΔCt的方法進(jìn)行計(jì)算。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.4MKN-28細(xì)胞miRNA-223-3p表達(dá)水平的RT-PCR檢測實(shí)驗(yàn)分為兩組：miRNA-223-3p對照組(轉(zhuǎn)染miRNA-223-3p對照)和miRNA-223-3p抑制組(轉(zhuǎn)染miRNA-223-3p抑制物)。取對數(shù)生長期的人胃癌細(xì)胞株MKN-28，2.5 g/L的胰蛋白酶消化細(xì)胞，觀察到細(xì)胞消化完全后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，1 000 r/min離心10 min，將上清去除，加入不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)液，在細(xì)胞培養(yǎng)板中接種，置于溫度37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行1 h培養(yǎng)。將miRNA-223-3p對照或miRNA-223-3p抑制物與培養(yǎng)液搖勻后加到胃癌細(xì)胞株MKN-28中，置于溫度37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行6 h培養(yǎng)后，換到含有FBS的完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。RT-PCR檢測2組細(xì)胞中 miRNA-223-3p的表達(dá)水平。

1.5MKN-28細(xì)胞增殖檢測取miRNA-223-3p對照組和miRNA-223-3p抑制組胃癌細(xì)胞，用細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)整為4×105mL-1，并接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，每孔加入細(xì)胞懸液100 μL，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48及72 h后，加入CCK8溶液10 μL，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱孵育4 h，在波長為450 nm處采用酶標(biāo)儀進(jìn)行測定并記錄其吸光度(A)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6MKN-28細(xì)胞凋亡率檢測miRNA-223-3p對照組和miRNA-223-3p抑制組胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，以1×106mL-1接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，取1 mL細(xì)胞懸液放于離心管，4 ℃1 000 r/min離心7 min，去除上清，經(jīng)過兩次洗滌后，加入Binding Buffer 200 μL搖勻，之后分別加入PI、Annexin-V，保持室溫，避光放置20 min，加入Binding Buffer 400 μL，采用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞凋亡率進(jìn)行檢測。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7MKN-28細(xì)胞遷移數(shù)檢測將轉(zhuǎn)染48 h的miRNA-223-3p對照組和miRNA-223-3p抑制組細(xì)胞密度調(diào)整為105mL-1，在Transwell小室下層加入含體積分?jǐn)?shù)10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基500 μL，其上層加入細(xì)胞懸液100 μL，培養(yǎng)24 h后，去除上下室培養(yǎng)基，上層分別加入上述兩組細(xì)胞，下層加入含體積分?jǐn)?shù)10% FBS的培養(yǎng)基，不同濃度均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，去除培養(yǎng)基，用棉簽將膜上細(xì)胞拭掉， HE染色后顯微鏡下觀察，選5個(gè)200倍視野拍照計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8MKN-28細(xì)胞中Bcl-2、Bax、Cleaved-Caspase3、JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)的Westernblot檢測取轉(zhuǎn)染48 h的miRNA-223-3p對照組和miRNA-223-3p抑制組胃癌細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞，取適量裂解液實(shí)施細(xì)胞裂解，時(shí)間為30 min，之后收集細(xì)胞，4 ℃14 000 r/min離心15 min，取上清液。蛋白濃度測定采用BCA試劑盒。將上樣緩沖液和蛋白樣品融合后，采用SDS-PAGE電泳實(shí)施分離，4 ℃轉(zhuǎn)膜過夜。將PVDF膜取出以50 g/L脫脂奶液實(shí)施封閉，分別加入一抗(1∶500稀釋)，4 ℃孵育過夜，TBST清洗后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶1 000稀釋)，37 ℃孵育1 h，TBST洗膜，采用ECL試劑盒顯色，顯影、定影、照相。采用Quantity One軟件檢測蛋白條帶灰度值，以GADPH為內(nèi)參，目的蛋白與內(nèi)參比值作為蛋白相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。胃癌組織和癌旁組織中miRNA-223-3p表達(dá)的比較采用配對資料的t檢驗(yàn)；miRNA-223-3p抑制組和miRNA-223-3p對照組miRNA-223-3p相對表達(dá)量，Bcl-2、Bax、Cleaved-Caspase3、JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白相對表達(dá)量，細(xì)胞凋亡率、遷移數(shù)的比較，均采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1miRNA-223-3p在胃癌組織中的表達(dá)胃癌組織中miRNA-223-3p的表達(dá)(3.672±0.468)顯著高于癌旁組織(0.956±0.015)(t配對=10.047，P=0.001)。

2.2 2組MKN-28細(xì)胞miRNA-223-3p的表達(dá)miRNA-223-3p抑制組(0.281±0.062)與miRNA-223-3p對照組(1.000±0.001)比較，miRNA-223-3p表達(dá)降低(t=20.086，P<0.001)。

2.3miRNA-223-3p對MKN-28細(xì)胞增殖的影響miRNA-223-3p抑制組與miRNA-223-3p對照組相比，細(xì)胞增殖受到抑制，見圖1。

圖1 2組MKN-28細(xì)胞生長曲線

2.4miRNA-223-3p對MKN-28細(xì)胞凋亡的影響miRNA-223-3p抑制組凋亡率(16.88%±1.23%)與miRNA-223-3p對照組(2.46%±0.56%)比較，細(xì)胞凋亡率升高(t=18.481，P<0.001)。

2.5miRNA-223-3p對MKN-28細(xì)胞中Bcl-2、Bax、Cleaved-Caspase3蛋白表達(dá)的影響miRNA-223-3p抑制組與miRNA-223-3p對照組相比，Bax和Cleaved-Caspase3蛋白表達(dá)升高，Bcl-2蛋白表達(dá)降低。見圖2、表1。

圖2 miRNA-223-3p對MKN-28細(xì)胞中Bax、Bcl-2及Cleaved-Caspase3蛋白表達(dá)的影響表1 2組MKN-28細(xì)胞中Bax、Bcl-2及Cleaved-Caspase3蛋白表達(dá)的比較

組別nCleaved-Caspase3Bcl-2BaxmiRNA-223-3p對照組30.077±0.0100.258±0.0120.164±0.011miRNA-223-3p抑制組30.134±0.0090.182±0.0090.293±0.013t7.3388.77613.121P0.0020.001<0.001

2.6miRNA-223-3p對MKN-28細(xì)胞中JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)的影響miRNA-223-3p抑制組與miRNA-223-3p對照組相比，JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)均降低。見圖3、表2。

圖3 miRNA-223-3p對MKN-28細(xì)胞中JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)的影響表2 2組MKN-28細(xì)胞中JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)的比較

組別nJAK2p-STAT3STAT3miRNA-223-3p對照組30.259±0.0150.248±0.0160.487±0.019miRNA-223-3p抑制組30.147±0.0110.124±0.0140.279±0.016t10.429 14.504 10.102 P0.001 <0.001 0.001

2.7miRNA-223-3p對MKN-28細(xì)胞遷移的影響結(jié)果顯示，miRNA-223-3p抑制組細(xì)胞遷移數(shù)(114.8±14.3)低于miRNA-223-3p對照組(185.6±8.9)(t=7.281，P=0.002)。

3 討論

在正常組織和癌旁組織中，miRNA的表達(dá)存在很大的差異，這些存在差異的miRNA可能作為癌基因或是抑癌基因在腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮作用[10-12]。研究[11]顯示，miRNA-223-3p參與實(shí)體腫瘤的發(fā)生，在胃癌患者胃黏膜組織中表達(dá)上調(diào)。本研究也發(fā)現(xiàn)miRNA-223-3p在胃癌組織中上調(diào)表達(dá)，這與上述研究結(jié)果一致。miRNA-223-3p可影響多種腫瘤發(fā)生發(fā)展，如miRNA-223可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖和遷移能力，上調(diào)結(jié)腸癌中miRNA-223-3p表達(dá)可抑制癌細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和阻滯細(xì)胞于G1期[13]。胃癌中miRNA-223-3p研究較少，有研究[14]發(fā)現(xiàn)miRNA-223-3p可通過靶向EPB41L3促進(jìn)胃癌的生長、遷移和侵襲，下調(diào)胃癌細(xì)胞中miRNA-223-3p表達(dá)可抑制細(xì)胞的增殖[15]。本研究旨在觀察miRNA-223-3p表達(dá)對胃癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移的影響，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miRNA-223-3p抑制物能顯著抑制細(xì)胞的增殖和遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

JAK2/STAT3途徑是STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活的關(guān)鍵途徑[16-17]。研究[18]顯示，大多數(shù)惡性腫瘤中有JAK、STAT的異常表達(dá)和過度激活，尤其是STAT3的激活。STAT3可通過調(diào)節(jié)下游的Bcl-2、Bax等調(diào)控細(xì)胞的凋亡，影響惡性腫瘤的發(fā)生[19]。胃癌中抑制JAK2/STAT3信號(hào)可抑制癌細(xì)胞生長[20]。Bcl-2家族中Bcl-2和Bax分別屬于抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白，影響細(xì)胞凋亡關(guān)鍵因素是Bcl-2/Bax比值，比值下降時(shí)細(xì)胞出現(xiàn)凋亡[21-22]。Caspase3是Caspase家族的代表，是一個(gè)凋亡執(zhí)行者，它可以與Bcl-2共同作用促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[23]。本研究結(jié)果顯示，下調(diào)miRNA-223-3p表達(dá)可降低JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)，上調(diào)Bax、Cleaved-Caspase3蛋白表達(dá)，提示miRNA-223-3p對胃癌細(xì)胞生長的影響與抑制JAK2/STAT3信號(hào)有關(guān)。

綜上，在胃癌組織中miRNA-223-3p呈現(xiàn)高表達(dá)，下調(diào) miRNA-223-3p表達(dá)能顯著抑制細(xì)胞增殖和遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制與JAK2/STAT3信號(hào)通路的調(diào)節(jié)有關(guān)。該研究結(jié)果為胃癌的診斷及治療提供了依據(jù)。