α1,3-D-半乳糖基轉移酶基因425C→T突變導致B3亞型分析

崔文燕，王鈺菁，鄒 緯，王學鋒，蔡曉紅

1)鄭州大學第二附屬醫院輸血科 鄭州 450014 2)上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院輸血科 上海 200025

ABO血型亞型是紅細胞膜上ABO血型抗原決定簇數量或性質發生改變所致，具有明確的血清學特點，并且具有遺傳基礎。ABO血型亞型產生的主要原因是ABO基因第6或第7外顯子發生了點突變或者ABO基因內發生了交換或重組，降低或改變了糖基轉移酶的活性，導致抗原弱表達或變異，致使血型血清學表現為紅細胞抗原凝集減弱，混合視野凝集，血清中出現不規則抗A、抗B抗體或抗A、抗B抗體凝集減弱，從而給血型鑒定工作帶來了困擾[1-4]。作者通過手術備血發現一例B3亞型，ABO血型鑒定正反定型不一致，對其家系采集標本并進行DNA突變位點研究，進一步探討B3亞型的分子機制及遺傳特性。

1 對象與方法

1.1研究對象先證者為瑞金醫院患者，男，92歲，漢族，既往無特殊病史，無輸血獻血史，家族中無遺傳病史。因膽囊結石行手術切除，ABO血型鑒定正反定型不一致，并用試管法進行復檢。采集其兒子、女兒血標本進行分析，家系圖見圖1。所有標本均為EDTA 抗凝外周靜脈血5 mL。

□：男性；○：女性； ■：B3亞型者；→：先證者圖1 家系圖譜

1.2試劑與儀器單克隆抗A、抗B試劑(批號：20161015)，ABO反定型標準紅細胞(批號:20175335)，不規則抗體篩檢號Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ細胞(批號：20170737)，抗H試劑(批號：20160707)均由上海血液生物醫藥有限責任公司提供；全自動血型分析儀(強生公司，型號：AutoVueInnova)；血液基因組DNA抽提試劑盒(德國QIGEN公司，批號：148039042)；TaKaRa LA Tap酶(日本TaKaRa公司，批號：RR02MA)；PCR儀(美國ABI公司，貨號：4483636)；DNA測序儀(美國ABI公司，型號：PRISM377)；離心機 (日本久保田公司，型號：KA-2200)。

1.3血清學檢測將EDTA抗凝外周全血離心取紅細胞做ABO血型正定型，血漿做反定型，并做自身對照。紅細胞H抗原檢測中取B細胞和O細胞為對照細胞，抗體篩查細胞檢測血清中有無不規則抗體。

1.4α1,3-D-半乳糖基轉移酶活性檢測①指示紅細胞的制備：挑選3人份O型獻血者紅細胞，用生理鹽水洗3遍，取壓積紅細胞10 μL，加入100 μL反應液[0.05 mol/L咪唑緩沖液(pH 6.5)10 μL，25 mmol/L氯化鎂10 μL，0.15 mol/L氯化鈉10 μL，0.5 mmol/L UDP-Gal 10 μL，體積分數0.5% BSA 10 μL，待檢血漿50 μL]中，總體積110 μL，37 ℃ 水浴4 h后用生理鹽水洗3遍，再配制成體積分數5%紅細胞懸液待用。②標準血清的稀釋：將單克隆抗B抗體用生理鹽水按體積比11、12、14、18、116、132、164、1128進行倍比稀釋后待用。③酶活性檢測：取50 μL的指示紅細胞懸液與50 μL不同稀釋度的單克隆抗B混和后置室溫反應20 min，1 000 r/min離心30 s，通過肉眼和顯微鏡觀察凝集強度，血漿酶活性強度以發生凝集的抗體最高滴度來表示，并選取B型和O型各3人份獻血者血漿做陽性和陰性對照。

1.5基因測序①DNA提取和PCR擴增。取200 μL白膜層血樣，用QIAamp試劑盒提取全基因組DNA，具體操作步驟參照試劑盒說明書進行。每個標本的反應液為50 μL：TaKaRa LA Taq酶(5 U/μL)0.5 μL，10×LA Taq PCR反應緩沖液Ⅱ5 μL，dNTP 混合液(2.5 mmol/L)8 μL，第6、7外顯子上下游引物各2 μL，DNA 4 μL，ddH2O 28.5 μL。使用的引物根據ABO基因序列(GenBank序列號：N_000009)參考文獻[5]設計。反應程序為95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s,72 ℃延伸50 s，30個循環；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。取3 μL PCR產物用于瓊脂糖凝膠電泳，剩余47 μL送上海生工生物工程技術服務有限公司進行檢測，并用Chromos軟件比對，分析測序結果。②基因測序及克隆。采用DNA瓊脂糖凝膠純化試劑盒純化PCR擴增產物，正反雙向測序，在ABI PRISM377測序儀上對第6和第7外顯子及其側翼序列進行測序。第7外顯子的PCR產物克隆到pMD18-T載體(TaKaRa公司產品)，PCR插入片段在ABI PRISM377測序儀上進行序列分析。

2 結果

2.1家系成員ABO血型血清學鑒定結果先證者術前備血時自動血型檢測系統發現ABO血型正定型抗B有混合視野凝集，反定型正常，自身對照陰性，見圖2，不規則抗體篩查陰性。立即進行試管法復驗，試管法發現正定型抗B顯示有混合視野凝集，反定型正常，鑒定為B3亞型。先證者兒子、女兒血型血清學檢測結果見表1。

1：抗A抗體；2：抗B抗體；3：抗D抗體；4：自身對照；5：A1細胞；6：B細胞

圖2 先證者自動血型檢測系統結果表1 B3亞型家系成員血型血清學檢測結果

2.2α1,3-D-半乳糖基轉移酶活性測定結果先證者及其兒子的血漿α1,3-D-半乳糖基轉移酶活性均<1；陽性對照為1∶64，陰性對照為<1。

2.3DNA測序及克隆分析結果先證者第6外顯子測序顯示：261缺失G雜合，297G→A。第7外顯子測序顯示： 425C→T，526G→C，657T→C，681A→G，703A→G，771T→C，796C→A，803C→G，930A→G。等位基因的命名遵循ISBT命名法。患者ABO基因第7外顯子存在c.425C→T雜合突變，克隆后的PCR產物測序結果顯示：c.425C→T突變位于患者的B等位基因上，即先證者ABO基因型為B305/O102(圖3)。425C→T突變導致α1,3-D-半乳糖基轉移酶的第142位氨基酸由甲硫氨酸轉變為蘇氨酸。先證者之子與先證者堿基突變位點一致，也存在425C→T突變，基因型鑒定為B305/O102；先證者之女為O102。

方框內的堿基為425突變位點圖3 先證者B3等位基因測序結果

3 討論

ABO血型基因定位于9q34.1-34.2[6]，基因多態性多位于第6和第7外顯子，錯位突變引起的氨基酸替換是導致ABO抗原表達減弱的主要原因[1]。目前對亞型基因判定最直接的方法是對ABO基因的第6和第7外顯子進行測序[7-8]。本研究通過對先證者家系基因測序發現，先證者血漿中α1,3-D-半乳糖基轉移酶活性很弱，存在c.425C→T位點突變，其兒子遺傳了該突變，最終確定為B305/O102亞型，符合孟德爾遺傳規律。這說明B3亞型除了具有明確的血清學特點外，還具有遺傳特性。與B101序列相比，425位點這一突變導致多肽鏈第142位甲硫氨酸被蘇氨酸替換。甲硫氨酸是含硫的兩性氨基酸，在代謝中起著重要作用，可以反應生成S-腺苷-I-甲硫氨酸，在反應中是甲基供體的服務器。蘇氨酸是含有羥基的親水分子氨基酸，替換甲硫氨酸可造成α1,3-D-半乳糖基轉移酶活性部分喪失，致使D-半乳糖通過糖基化作用與前體H物質的連接發生部分失活，使得B抗原合成量減少，出現了混合視野。先證者紅細胞與抗H抗體作用后增強也佐證了這一點。

ABO亞型具有相對特殊的血清學特征，混合視野凝集是B3亞型紅細胞的明顯特征，顯微鏡下觀察，B3亞型紅細胞與抗B或抗AB血清孵育后出現一些被絕大部分游離的非凝集紅細胞包圍的數個紅細胞形成的凝集塊[9]。若將凝集細胞去除，剩余的游離細胞再與抗B血清反應，仍然出現混合視野凝集。對先證者進行血清學檢測發現，紅細胞與抗B抗體作用出現混合視野凝集、反定型一致，不規則抗體篩查陰性，鑒定為B3亞型；采集其兒子、女兒血標本進行檢測，兒子與父親血型一致，正定型抗B出現混合視野凝集，反定型B型，鑒定為B3亞型，女兒為O型。

B基因編碼α1,3-D-半乳糖基轉移酶，其功能是轉移一個D-半乳糖到H物質的巖藻糖化半乳糖殘基上，形成B抗原。ABO基因位點突變可導致相應糖基轉移酶的異常，從而出現ABO亞型。本文通過α1,3-D-半乳糖基轉移酶活性測定顯示先證者血漿中α1,3-D-半乳糖基轉移酶活性<1，提示先證者血漿中α1,3-D-半乳糖基轉移酶活性很弱，B3亞型等位基因編碼的糖基轉移酶運轉能力差，這可能與亞型血型本身紅細胞上的B抗原量少、糖基轉移酶活性低有關。

目前發現[10]，425堿基突變C→T存在于2種等位基因上：在A等位基因上突變導致Ael表型，在B等位基因上突變導致B3表型。許先國等[11]報道的2例B305等位基因與A1(A101或A102)等位基因組合遺傳表現為B3變異型，出現混合外觀凝集現象；李歸冀等[12]報道B305與O101等位基因組合在一起，血清學表現為比正常B抗原凝集稍弱，未出現B3血型特異性的混合外觀表現。而在本例樣本中發現，B305與O102組合在一起，表現出混合視野凝集。這表明B305與不同等位基因組合，血清學表現會有所不同，這還需要進一步的群體調查或者體外表達去驗證。

ABO 系統是人類發現最早的血型系統，也是最常用最重要的血型系統，在臨床輸血、新生兒溶血病和器官移植中具有很重要的臨床意義[13]，但是在ABO血型系統中存在一部分亞型，導致血型正反定型不符，對鑒定血型造成了一定的干擾[14]。鑒于ABO血型抗原表達的復雜性，采用血型血清學檢測與基因分型相結合的方法，對血型的正確定型以及臨床安全輸血具有重要意義。