楊梅素通過促進DRP1依賴性線粒體分裂誘導人卵巢癌SKOV3細胞凋亡

于 洋，徐 路，劉師兵，李松巖，徐 冶

(吉林醫藥學院基礎醫學院腫瘤靶向治療與轉化醫學實驗室，吉林 吉林 132013)

楊梅素是提取于楊梅科楊梅屬植物楊梅果實的一種酮類化合物。植物黃酮類均具有較強的抗氧化活性[1-2]，使其具有一定抑菌作用[3-4]、免疫因子激活作用[5-6]和抗衰老作用[7-8]等生物學活性；曾有研究者[9]對楊梅素的抑制腫瘤生長作用作出過相應報道，但具體機制尚不十分明確。線粒體功能的維持是細胞正常運轉的重要保證，線粒體動力學是目前針對于線粒體功能研究的焦點之一，主要包括內外線粒體膜的融合和分裂，這個相反的過程有助于維持線粒體的正常生理功能[10-11]。線粒體過度融合常導致巨型線粒體的產生，常見于病變肝細胞或營養不良患者胰腺細胞等[12]；反之，若線粒體過度分裂，則會導致線粒體形成碎片，使線粒體部分或完全喪失基本功能，誘發線粒體自噬甚至導致線粒體途徑凋亡的發生[13]。卵巢癌發病率位居女性生殖腫瘤第3位，目前已成為女性生殖腫瘤致死的首要病因[14]。在臨床化療過程中出現的不同程度腫瘤耐藥促使人們找尋更為低毒高效的生物制劑或化學藥物來抑制或殺滅腫瘤細胞。本課題組前期研究[15]顯示：楊梅素對于人卵巢癌細胞有明顯的凋亡誘導作用。本研究在前期研究基礎上，以楊梅素作用于人卵巢癌SKOV3細胞，結合特異性動力相關蛋白1(dynamin related protein 1, DRP1)抑制劑—mdivi/1，觀察楊梅素誘導SKOV3細胞株凋亡過程中線粒體分裂情況，探討楊梅素抗腫瘤的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器 SKOV3細胞由吉林大學病理生理學系惠贈。Muse○R細胞狀態分析儀凋亡檢測試劑盒購于美國Muse○R試劑公司，所有一抗均購于美國Santa Cruz公司，新生牛血清、RPMI 1640培養基購于美國Gibco○R公司，二抗及其他試劑購于北京鼎國生物試劑公司。860型酶標儀，美國Bio-Rad公司；化學發光儀，中國上海天能科技有限公司；FV1000型共聚焦顯微鏡，日本Olympus公司；Muse○R細胞狀態分析儀，美國默克密理博公司。

1.2 細胞培養和分組 SKOV3細胞用含體積分數為10%新生牛血清的1640培養液，置37℃、5% CO2培養箱中培養，隔2～3 d傳代1次。取生長狀態良好對數生長期細胞，隨機分為對照組、mdivi-1組、楊梅素組和聯合給藥組，對照組不做干預，mdivi-1組以50 μmol·L-1mdivi-1作用1 h后更換含細胞培養液繼續培養23 h，楊梅素組以50 g·L-1楊梅素作用24 h，聯合給藥組以50 μmol·L-1mdivi-1作用1 h后更換含50 g·L-1楊梅素的細胞培養液繼續培養23 h。

1.3 MTT法檢測各組細胞存活率 先將細胞接種至96孔板，按1.2中分組方法進行分組及給藥處理24 h后，每孔加入5 g·L-1MTT溶液10 μL，繼續培養4 h。棄上清，每孔加入100 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。最后以酶標儀測490 nm處各孔吸光度(A)值，計算細胞存活率。 細胞存活率 =(給藥組A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A值)×100%。

1.5 Western blotting法檢測各組細胞中相關蛋白表達水平 按1.2中分組方法分組并干預SKOV3細胞，以胰蛋白酶消化離心收集全部細胞，收集后的每管細胞加入120 μL RIPA細胞裂解液，混勻后，冰浴下用細胞超聲粉碎儀超聲粉碎2次，每次5～10 s，放入4℃冰箱45 min，充分裂解細胞。離心，收集上清液，以96孔板蛋白定量后，所余部分上清液與5×SDS Loading緩沖液按4︰1體積比混勻后進行蛋白變性。變性后的蛋白提取液進行SDS-PAGE電泳，電泳條件：濃縮膠100 V、30 min、分離膠200 V、60 min，電泳結束后，利用濕轉法將膠內蛋白轉移到PVDF膜上，將膜用5%脫脂奶粉封閉1.5 h后，PBST洗3次，加入以一抗稀釋液200倍稀釋后的檢測目標一抗，分別為：β-肌動蛋白(β-actin)、細胞色素C(cytochrome C，Cyt C)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cysteine-containing aspartate-specific proteases 3，caspase3)、動力相關蛋白1(dynamin related protein 1，DRP1)和分裂蛋白1(fission 1，FIS1)，4℃孵育過夜。次日PBST洗3次，加入過氧化物酶標記的相應二抗(1︰1 000稀釋)，室溫下搖床搖1 h，PBST洗3次，ECL發光并拍照，以β-actin作為內參照對各組蛋白表達變化灰度進行對比分析，并對蛋白表達水平進行統計學分析。蛋白表達水平=每個樣本條帶灰度值/β-actin灰度值。

1.6 MitoTracker○RRed觀察線粒體形態 按1.2中分組方法進行分組及給藥處理，制備細胞爬片后，以MitoTracker○RRed 250 μmol·L-1，37℃孵育30 min；以Hoechst 33342 染核2 min后，激光共聚焦顯微鏡觀察線粒體形態。

2 結 果

2.1 各組人卵巢癌SKOV3細胞存活率 與對照組(100%)比較，mdivi-1組細胞存活率(97.28%±4.12%)無明顯降低(P>0.05)，楊梅素組細胞存活率(52.17%±6.28%)明顯降低(P<0.05)，而聯合給藥組細胞存活率(63.87%±5.68%)明顯高于楊梅素組(P<0.05)。

2.2 各組人卵巢癌SKOV3細胞凋亡率 與對照組[細胞凋亡率(5.89%±1.12%)]比較，mdivi-1組細胞凋亡率(5.99%±2.28%)無明顯變化(P>0.05)，楊梅素組細胞凋亡率(45.35%±5.38%)升高(P<0.05)，聯合用藥組細胞凋亡率(32.62%±4.47%)低于楊梅素組(P<0.05)。見圖1。

A:Control group;B:Mdivi-1 group;C:Myricetin group;D:Combined group.

2.3 各組人卵巢癌SKOV3細胞凋亡相關蛋白表達水平 與對照組比較，楊梅素組細胞中Cyt C和caspase3蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)；聯合用藥組細胞中Cyt C和caspase3蛋白表達水平較楊梅素組均明顯下降(P<0.05)。見圖2。

2.4 各組人卵巢癌SKOV3細胞線粒體分裂情況 經MitoTracker○RRed熒光探針特異性標記線粒體后激光共聚焦顯微鏡觀察線粒體分裂情況，結果顯示：mdivi-1組細胞中線粒體熒光染色表現與對照組基本一致；楊梅素組細胞內紅色熒光增強，且較對照組線粒體的條索樣結構呈現明顯粗糙砂礫樣改變，說明楊梅素組細胞內線粒體分裂趨勢較對照組增強；與楊梅素組比較，聯合給藥組細胞中線粒體熒光染色砂礫感下降，亮度減弱，說明線粒體分裂程度下降。見圖3(插頁一)。

Lane 1:Control group; Lane 2:Mdivi-1 group; Lane 3:Myricetin group; Lane 4:Combined group.*P<0.05vscontrol group；△P<0.05vsmyricetin group.

圖2 各組SKOV3細胞中Cyt C和caspase3蛋白表達電泳圖(A)和直條圖(B)

Fig.2 Electrophorogram(A) and histogram(B) of expressions of Cyt C and caspase3 proteins in SKOV3 cells in various groups

2.5 各組人卵巢癌SKOV3細胞中線粒體分裂相關蛋白表達水平 Western blotting 結果顯示：楊梅素組細胞中DRP1和FIS1表達水平較對照組明顯升高(P<0.05)，而聯合用藥組DRP1和FIS1表達水平較楊梅素組均明顯降低(P<0.05)。見圖4。

Lane 1:Control group; Lane 2:Mdivi-1 group; Lane 3:Myricetin group; Lane 4:Combined group.*P<0.05vscontrol group；△P<0.05vsmyricetin group.

圖4 各組SKOV3細胞中DRP1和FIS1蛋白表達電泳圖(A)和直條圖(B)

Fig.4 Electrophorogram(A) and histogram(B) of expressions of DRP1 and FIS1 proteins in SKOV3 cells in various groups

3 討 論

線粒體是真核細胞內的重要細胞器，其參與能量代謝、信號傳導和細胞凋亡等眾多生理病理學過程。線粒體具有網狀結構，且由于線粒體的分裂和融合，致使該網狀結構長期處于動態變化中。新近研究[16]證實：線粒體分裂是細胞凋亡過程早期發生的細胞器形態改變，而線粒體融合則對腫瘤細胞凋亡有抑制作用[17]。線粒體分裂和融合過程受多種蛋白的精確調控，線粒體分裂對外界刺激和代謝信號高度敏感。研究[18-19]表明：多種信號通路和大量信號分子參與該過程。DRP1是調節線粒體融合和分裂的關鍵蛋白，正常情況下其主要定位于細胞質，經過裂變信號刺激，DRP1轉移到線粒體，與FIS1結合共同參與線粒體分裂過程[13]。本研究將楊梅素作用于人卵巢癌SKOV3細胞，結果顯示：楊梅素具有明顯降低細胞存活率和凋亡誘導作用，Cyt C和caspase3表達水平變化提示該凋亡與線粒體功能有密切關聯，線粒體熒光探針和DRP1、FIS1蛋白表達水平變化也提示楊梅素組SKOV3細胞內線粒體分裂明顯增強。為了進一步明確楊梅素所誘導凋亡的具體機制及與線粒體分裂之間的關系，本研究進一步引入mdivi-1，通過抑制DRP1功能抑制線粒體分裂[20-22]，將其與楊梅素聯用后，楊梅素的凋亡誘導作用明顯受到抑制，說明楊梅素該作用是DRP1依賴性的，楊梅素很可能通過上調DRP1表達來促進SKOV3細胞線粒體分裂從而發揮凋亡誘導作用。本研究結果在相關楊梅素抗癌作用的研究中是較為新穎的發現，國內外尚無相關類似報道。本研究結果對完善楊梅素及其同類衍生物抗癌作用的機制具有一定意義，也為新型低毒高效抗腫瘤藥物的研發提供參考。