低劑量輻射誘導小鼠睪丸細胞中IRE1α和XBP1 mRNA及其蛋白的表達

于 雷，唐 庚，方 芳，李 鑫，龔守良，王志成，王劍鋒

(1.吉林大學第二醫院放療科，吉林 長春 130041；2.吉林大學公共衛生學院 衛生部放射生物學重點實驗室，吉林 長春 130021；3.吉林大學中日聯誼醫院放療科，吉林 長春 130033)

2011年日本福島核電站泄漏事件后，輻射高本底環境是否影響人類健康再次引起廣泛關注，其焦點是致癌問題。低劑量輻射(low dose radiation，LDR)的生物效應區別于高劑量誘導的損傷，但LDR誘導的效應仍不確定[1-2]。LDR誘導的損傷效應主要依據是線性無閾模型(linear no threhold,LNT)，任何劑量的電離輻射都有致癌的可能性[3-4]。但也有學者[5-6]認為：LDR可誘導適應性反應和興奮性效應。睪丸是輻射敏感的器官，極低劑量就能引起睪丸生精細胞凋亡[7-8]，并且具有一定的劑量和時程-效應規律性。前期研究[9]顯示：LDR能夠誘導小鼠睪丸生精細胞內質網應激的發生，并且啟動了凋亡信號通路。肌醇需求酶1(inositol-requiring enzyme-1,IRE1)是一種定位在內質網膜的具有激酶和核酸內切酶活性的雙功能酶，可以被內質網應激激活，從而激活多條下游信號通路，其中X盒結合蛋白1(X box-binding protein-1,XBP1)是最早發現并且最受關注[10]，是重要的內質網應激信號調節通路。本實驗旨在通過檢測LDR后小鼠睪丸細胞中肌醇需求酶1α(inositol-requiring enzyme-1α,IRE1α)、Total-XBP1(T-XBP1)、spliced XBP1(S-XBP1 )mRNA及蛋白的表達，闡明IRE1-XBP1通路的激活在LDR誘導小鼠睪丸內質網應激信號調控中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和照射處理方法 50只健康雄性ICR小鼠，體質量(18±2)g，由吉林大學白求恩醫學部實驗動物中心提供，動物合格證號：SXCK(吉)203-00007，隨機分為10組，每組5只。時程-效應實驗為75 mGy照射后0、3、6、12和24 h處死動物，劑量-效應實驗為0、50、75、100和200 mGy照射后12 h處死動物。應用國產固定式X射線深部治療機(XSZ-220/20X型，丹東市康嘉儀器設備有限公司)進行全身照射，電壓180 kV，電流15 mA，劑量率為12.5 mGy·min-1。

1.2 主要試劑和儀器 TRIzol(美國Invitrogen公司)，焦碳酸二乙酯(DEPC,上海生工生物公司)，反轉錄試劑盒(加拿大MBI Fermentas公司)，IRE1α、T-XBP1、S-XBP1和GAPDH引物及real time PCR試劑盒(大連寶生物公司)，ECL發光試劑盒,IRE1α、T-XBP1、S-XBP1(兔抗鼠多克隆)和GAPDH(山羊抗鼠多克隆)一抗(美國Santa Cruz公司)，辣根過氧化酶標記的抗兔及抗山羊二抗(北京中杉金橋公司)，其他試劑為國產分析純；PCR儀(美國Perkin-Elmer公司)，Mx3000P real time PCR儀(美國Stratagene公司)，Mini-PROTEAN 3 Dodeca微型電泳槽(美國Bio-Rad公司)。

1.3 實時定量PCR法檢測小鼠睪丸細胞中IRE1α、T-XBP1和S-XBP1 mRNA表達水平 IRE1α引物：5′-CATGAGGAACAAGAAGCACCACTA-3′(上游序列)，5′-TCGCTGTGTGAAGTACTGAATGAA-3′(下游序列)；T-XBP1引物：5′-TGGGCATTCTGGACAAGTT-3′(上游序列)，5′-GAAAGGGAGGCTGGTAAGG-3′(下游序列)；S-XBP1引物：5′-CTGAGTCCGAATCAGGTGCAG-3′(上游序列)，5′-GTCCTAGGGAAGATGTTCTGG-3′(下游序列)；GAPDH引物：5′-AAATGGTGAAGGTCGGTGTG-3′(上游序列)，5′-TGAAGGGGT-CGTTGATGG-3′(下游序列)。用TRIzol試劑提取各組睪丸細胞中總RNA后，采用反轉錄試劑盒合成互補DNA(cDNA)，MX3000P real time PCR系統進行PCR擴增并分析。每組隨機選擇5只小鼠左側睪丸樣本，每個樣本設3個復孔。每個樣本的mRNA表達水平用各自內參照GAPDH表達水平進行標準化，以目的mRNA與GAPDH mRNA比值為該基因的相對表達水平，同時將對照組目的mRNA相對表達水平設定為1[8]。

1.4 Western blotting法檢測小鼠睪丸細胞中IRE1α、T-XBP1和S-XBP1蛋白表達強度 將上述5只小鼠右側睪丸組織提取總蛋白并進行蛋白定量。每個樣品取20 μg上樣，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳時，濃縮膠采用60 V恒壓，分離膠采用90 V恒壓。蛋白轉移至硝酸纖維膜上，膜經新鮮配制的封閉液(1×TBS，5%脫脂奶粉，0.05% Tween-20)常溫封閉1 h，加入按一定比例稀釋后的IRE1α、T-XBP1、S-XBP1和GAPDH一抗，4℃過夜，用含0.05% Tween 20的TBST洗滌2次，每次15 min，加入按一定比例稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗，37℃震蕩孵育1 h；用ECL發光試劑盒進行發光，X射線片曝光顯影，照相后進行分析，結果以條帶灰度值表示蛋白表達強度。實驗重復3次。

2 結 果

2.1 75 mGy X射線照射后不同時間小鼠睪丸細胞中IRE1α、T-XBP1和S-XBP1 mRNA表達水平和蛋白表達強度 除3 h組小鼠睪丸細胞中T-XBP1和S-XBP1 mRNA表達水平降低外，其他各時間組IRE1α、T-XBP1和S-XBP1 mRNA表達水平均隨時間延長而升高，并在6 h達到峰值，而后逐漸降低。與0 h組比較，6、12和24 h組小鼠睪丸細胞中IRE1α mRNA表達水平及6和12 h組T-XBP1、S-XBP1 mRNA表達水平均明顯升高(P<0.05或P<0.01)；與0 h組比較，不同時間組IRE1α和S-XBP1蛋白表達強度增加， 6和12 h組IRE1α蛋白表達強度及24 h組S-XBP1蛋白表達強度最高，而T-XBP1蛋白表達強度稍有降低。見表1和圖1。

表1 75 mGy X射線照射后不同時間各組小鼠睪丸細胞中IRE1α、T-XBP1和S-XBP1 mRNA表達水平

Tab.1 Expression levels of IRE1α,T-XBP1 and S-XBP1 mRNA in mouse testis cells at different time after 75 mGy irradiation in various groups (n=5,±s)

*P<0.05，**P<0.01vs0 h group.

Lane 1：0 h group；Lane 2：3 h group；Lane 3：6 h group；Lane 4：12 h group；Lane 5：24 h group.

圖1 Western blotting法檢測75 mGy X射線照射后不同時間各組小鼠睪丸細胞中IRE1α、T-XBP1和S-XBP1蛋白表達電泳圖

Fig.1 Electrophoregram of expressions of IRE1α,T-XBP1 and S-XBP1 proteins in mouse testis cells at different time after 75 mGy X-ray irradiation in various groups detected by Western blotting method

2.2 不同劑量X射線照射后小鼠睪丸細胞中IRE1α、T-XBP1和S-XBP1 mRNA表達水平和蛋白表達強度0～200 mGy X射線全身照射后12 h，隨照射劑量的增加，各組小鼠睪丸細胞中IRE1α、T-XBP1和S-XBP1 mRNA表達水平升高，75 mGy組升高達峰值后逐漸降低，甚至降至0 mGy組以下。與0 mGy組比較，75和200 mGy組小鼠睪丸細胞中IRE1α mRNA表達水平、75 mGy組T-XBP1和S-XBP1 mRNA表達水平明顯升高(P<0.05或P<0.01)。與0 h組比較，各劑量組小鼠睪丸細胞中IRE1α和S-XBP1蛋白表達強度升高，75 mGy組IRE1α蛋白表達強度、75和200 mGy組S-XBP1蛋白表達強度升高最明顯，而T-XBP1蛋白表達強度無明顯變化。見表2和圖2。

表2 不同劑量X射線照射后12 h各組小鼠睪丸細胞中IRE1α、T-XBP1和S-XBP1 mRNA表達水平

Tab.2 Expression levels of IRE1α,T-XBP1 and S-XBP1 mRNA in mouse testis cells 12 h after irradiation with different doses of X-ray in various groups (n=5,±s)

*P<0.05，**P<0.01vs0 mGy group.

Lane 1：0 mGy group；Lane 2：50 mGy group；Lane 3：75 mGy group；Lane 4：100 mGy group；Lane 5：200 mGy group.

圖2 Western blotting法檢測不同劑量X射線照射后12 h各組小鼠睪丸細胞中IRE1α、T-XBP1和S-XBP1蛋白表達電泳圖

Fig.2 Electrophoregram of expressions of IRE1α,T-XBP1 and S-XBP1 proteins in mouse testis cells 12 h after different doses of X-ray irradiation in various groups detected by Western blotting method

3 討 論

隨著核電和核技術應用越來越廣泛，由此產生的輻射對人體健康的影響也日漸增加，尤其是LDR所引發的問題已經成為放射醫學領域的研究熱點。過去20多年來，LDR的生物學效應特別是導致生殖及遺傳效應引起諸多研究者的關注。睪丸組織是輻射敏感器官，睪丸細胞群主要包括精原細胞、精母細胞、精子細胞和精子，以及Lydig和Sertoli細胞；其中，精原細胞及精母細胞對輻射敏感，而精子細胞和精子以及Lydig和Sertoli細胞則表現為輻射抵抗。因此，LDR誘導睪丸細胞的凋亡以精原細胞和精母細胞為主，很少涉及到精子細胞和精子以及Lydig和Sertoli細胞，這一點本研究前期的相關研究已經證實[7]。睪丸組織是輻射敏感器官，低至100 mGy的單次劑量照射損傷分裂中的精原細胞，導致生精障礙[11-12]。在放射治療中睪丸組織分次照射生精小管損傷也會增加，主要可能是由于干細胞的重復激活導致的，對于生精上皮來說，多種低程度的遺傳損傷甚至比高程度的損傷更嚴重[13]。因此，研究LDR對睪丸生殖損傷則有望提出相應的新理論和新機制。

內質網是真核細胞中蛋白質合成、折疊和分泌的重要細胞器，內質網內環境的穩定是實現內質網功能的基本條件,因此內質網具有極強的內穩態體系。在氧化應激、缺氧和電離輻射等條件下，內質網內未折疊和錯誤折疊的蛋白明顯增多，超出了內質網處理能力時，細胞會激活相關的信號級聯反應來應對條件的變化，并恢復內質網良好的環境，這種情況被稱為內質網應激，當應激發生程度較低時則細胞可以正常分裂，恢復生命；而當應激過載時則激活下游凋亡通路信號分子，誘導細胞凋亡。參與內質網應激的信號調控的3個重要的跨膜蛋白分別為：雙鏈RNA依賴的蛋白激酶樣內質網激酶(PKR-like ER kinase，PERK)、活化轉錄因子6(activating transcription factor-6，ATF6)和IRE1，均可與下游相應的分子構成獨立的或互為網狀的信號通路。IRE1被激活后能夠切割下游XBP1 mRNA(T-XBP1)形成切割體mRNA(S-XBP1)，進而導致該通路的激活[14-18]。本課題組前期研究顯示：LDR能夠誘導睪丸細胞發生內質網應激，并且激活了PERK-CHOP凋亡通路[8]，但是內質網應激能否激活ATF6和IRE1通路尚不明確。本實驗通過檢測75 mGy照射后0～24 h和0～200 mGy照射后12 h各組小鼠睪丸細胞中IRE1α、T-XBP1和S-XBP1 mRNA表達水平及蛋白表達強度變化來判斷發生內質網應激的可能，結果顯示：75 mGy照射后0～24 h，隨著時間延長，小鼠睪丸細胞中IRE1α mRNA表達水平及蛋白表達強度逐漸增加，分別在6 和/或12 h達到峰值而后降低；T-XBP1和S-XBP1與IRE1α mRNA表達時程變化趨勢相似，S-XBP1蛋白隨時間延長逐漸增加，但是在照射后24 h表達最高，而T-XBP1蛋白表達有降低趨勢但不明顯；0～200 mGy照射后12 h，隨著劑量的增加，小鼠睪丸細胞中IRE1α、T-XBP1和S-XBP1 mRNA表達水平的變化趨勢基本一致，即75 mGy照射后其表達水平最高，而后逐漸減低甚至降至0 mGy組水平以下。IRE1α和S-XBP1蛋白表達強度分別在75和200 mGy照射后達最強，而T-XBP1蛋白表達強度無明顯的變化。本研究結果表明：LDR能夠誘導小鼠睪丸細胞中IRE1α mRNA表達水平及蛋白表達強度增加，進而切割T-XBP1 mRNA形成S-XBP1 mRNA。理論上T-XBP1 mRNA被切割后其表達減少，但是其表達也隨著時間延長而增加，可能與輻射后時間不同有關[19-20]。本研究結果提示：LDR能夠誘導小鼠睪丸細胞IRE1-XBP1內質網應激通路的激活。本結果為研究LDR誘導睪丸細胞凋亡機制提供了必要的補充，為電離輻射防護政策和法規的制訂提供了實驗數據。