京尼平對胃癌SGC 7901細胞體外增殖、侵襲能力和凋亡的影響及其機制

閻 慧，馬淑飛，段明華，閆玉禮，潘 新，李海清，周長龍，趙天倚

(1.長春中醫藥大學基礎醫學院生物化學教研室，吉林 長春 130117；2.國藥一心制藥有限公司研發中心項目管理室，吉林 長春 130022；3.長春中醫藥大學藥學院生物制藥與保健食品教研室，吉林 長春 130117；4.空軍航空大學飛行訓練基地飛行二大隊，吉林 長春 130022)

胃癌是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，有明顯的地域性差別。靶向治療可針對性地殺傷癌細胞，減輕正常細胞損害。目前胃癌靶向治療藥物種類及作用均有限。靶向治療藥物主要有表皮生長因子受體抑制劑、血管生成抑制劑、細胞周期抑制劑、細胞凋亡促進劑和基質金屬蛋白酶抑制劑等。京尼平(genipin，GP)的制備方法一般采用從梔子中提取京尼平苷(geniposide)[1]，再用β-葡萄糖苷酶水解，然后用乙醚萃取、真空濃縮、重結晶而制得，也可以采用微生物轉化法制備[2]。京尼平苷在杜仲和梔子中含量均較高，達到3%～8%，但由于梔子栽培容易、產量大，因此GP的生產主要以梔子為原料。GP來源于京尼平苷，在抗腫瘤、抗血栓、抗炎和治療糖尿病等方面療效顯著，作為一種新興的藥物中間體具有很多新型的、重要的藥理價值[3]。研究[4-6]表明:GP可有效抑制前列腺癌(AIPC)、腎癌細胞株(GRC-1)和前列腺癌細胞(PC-3)的增殖。但目前GP對胃癌SGC 7901的影響尚不清楚，未見相關研究報道。因此，本實驗通過檢測GP對SGC 7901細胞增殖、遷移和凋亡的影響，進一步探討其對SGC 7901細胞的促凋亡作用，闡明其對胃癌細胞抑制和促凋亡機制，為胃癌的臨床治療提供更多實驗數據。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑和主要儀器 胃癌SGC 7901細胞(湖南豐暉生物)，RPMI培養基、胎牛血清、乙二胺四甲酸(EDTA)、胰蛋白酶、GP和噻唑藍(MTT)(吉林省金泰生物試劑有限公司)，全蛋白提取試劑盒、RIPA裂解液和SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(美國Sigma公司)，PVDF膜(美國密理博公司)、β-actin、小鼠抗人Bcl-2抗體、小鼠抗人Bax抗體和小鼠抗人caspase-3抗體(美國BD公司)。Olympus倒置顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 細胞株培養 將細胞株復蘇后，用含10%胎牛血清的高糖RPMI 1640培養基放置于37℃、5% CO2恒溫培養箱培養。2～3 d傳代1次，傳代3次后，進行細胞實驗。

1.3 細胞分組 經查閱文獻[7]和預實驗，初步確定GP濃度為10 mg·L-1。將胃癌SGC 7901細胞分為4組：對照(DMSO)組，低、中和高劑量(5、10和20 mg·L-1)GP組。

1.4 MTT法檢測胃癌SGC 7901細胞增殖抑制率 取對數生長期細胞，用含0.02% EDTA的0.25%胰蛋白酶消化，調整細胞密度為2×105mL-1，接種于96孔板，接種量為每孔100 μL，培養24 h棄去培養基，加入3個藥物實驗組和DMSO對照組，每組藥物3個復孔，每孔100 μL。放置于37℃、5% CO2恒溫培養箱培養，分別培養24、48和72 h，于培養結束前4 h加入MTT(5 μg·L-1)20 μL，恒溫培養箱內孵育4 h，于離心機2 500 r·min-1離心15 min，吸盡上清，加入DMSO 150 μL，100 r·min-1振蕩10 min，用酶標儀測定吸光度(A)值，計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率 = [1-實驗組A(490)值/對照組A(490)值] × 100%。

1.5 Transwell小室實驗檢測細胞侵襲能力 用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化對數生長期細胞，細胞密度稀釋至2 × 105mL-1，根據MTT實驗結果，選擇MTT作用效果比較明顯的GP濃度，加入細胞懸浮液中，使藥物終濃度為10和20 mg·L-1。將GP加入RPMI 1640培養基中，使藥物終濃度為10和20 mg·L-1，然后加入胎牛血清，使其濃度為10%。吸取200 μL含有不同濃度(10和20 mg·L-1)GP的細胞懸液接種于Transwell小室上室，下室加入含10%胎牛血清的不同濃度(10和20 mg·L-1)GP的RPMI 1640培養基800 μL，同時設DMSO對照組，分別培養24、48和72 h后，去掉Transwell小室半透膜，PBS清洗2次，多聚甲醛固定30 min，0.1%結晶紫染色20 min，用棉簽輕輕擦拭去除半透膜上未穿透膜細胞，PBS清洗3次，普通顯微鏡下隨機選取5個視野觀察細胞并計數，以穿膜的細胞個數表示細胞的侵襲能力。

1.6 Western blotting法檢測各組細胞中Bax、Bcl-2和caspase-3蛋白表達水平 在6孔細胞培養板，GP作用于細胞48 h后，棄去培養基，用PBS洗滌細胞2次。每孔加入RIPA裂解液100 μL，刮下底部細胞，吹打成單細胞懸液。根據BCA蛋白測定試劑盒(全蛋白提取試劑盒)要求，繪制標準曲線，并進行樣品蛋白濃度測定。灌制4%濃縮膠和12%分離膠進行SDS-PAGE凝膠電泳，PVDF膜轉膜，封閉。分別加入Bax、Bcl-2和caspase-3-抗，4℃孵育過夜，室溫搖床孵育2 h，漂洗3次，分別加入HRP標記的二抗，室溫孵育2 h，漂洗3次。取膜，壓片，檢測，用分析軟件Quanlity One分析目的條帶的相對灰度值(以β-actin作為內參)，以Bax/β-actin表示Bax蛋白表達水平，以Bcl-2/β-actin表示Bcl-2蛋白表達水平，以caspase-3/β-actin表示caspase-3蛋白表達水平[8]。

2 結 果

2.1 MTT法檢測各組SGC 7901細胞增殖抑制率 不同濃度GP(5、10和20 mg·L-1)作用于胃癌SGC 7901細胞 24、48和72 h后，其增殖抑制率均升高，與對照組比較差異均有統計學意義(P<0.05)，且呈時間-濃度依賴性。見表1。

表1 各組SGC 7901細胞增殖抑制率

*P<0.05vscontrol group.

2.2 Transwell小室細胞侵襲實驗檢測SGC 7901細胞穿膜細胞數 10和20 mg·L-1GP作用于胃癌SGC 7901細胞后，檢測穿膜細胞數。Transwell小室檢測結果：與對照組比較，10和20 mg·L-1GP組穿膜細胞數明顯降低(P<0.05)，且呈時間-濃度依賴性。見圖1(插頁二)和圖2。

2.3 Western blotting法檢測各組細胞中Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表達水平 作用48 h后，與對照組比較，5、10和20 mg·L-1GP組SGC 7901細胞中Bcl-2蛋白表達水平降低(P<0.05)，Bax和caspase-3蛋白表達水平升高(P<0.05)。見圖3和4。

3 討 論

癌癥是一種復雜的疾病，單純的靶向治療并不能有效抑制腫瘤的生長和轉移，通過藥物來抑制細胞存活，也會導致藥效變差，因此尋找能夠調節腫瘤生存或凋亡的信號分子，是治療腫瘤的關鍵[9]。本研究采用MTT法檢測GP對胃癌SGC 7901細胞的增殖調節作用與其濃度和時間的關系。本研究結果表明：培養24 h，當GP濃度為5 mg·L-1時，對細胞增殖抑制率僅為11.18%，隨著給藥濃度增加和給藥時間延長，對胃癌細胞抑制作用逐漸增強；培養72 h，當濃度為20 mg·L-1時，對細胞增殖抑制率高達50.56%。本研究中Transwell小室細胞侵襲實驗結果表明：與對照組比較，10和20 mg·L-1GP能明顯降低胃癌SGC 7901細胞的遷移和侵襲能力。Bcl-2基因家族及其相關蛋白Bcl-2是最早被發現與凋亡有關的基因[10-11]，也是目前最受重視的調控細胞凋亡的基因家族。Bax和Bcl-2通過形成同源或異源二聚體來調節細胞凋亡。caspase-3是半胱氨酸蛋白酶[12]，使用半胱氨酸裂解的多肽鏈中的硫原子切割caspase-3的活性形式，觸發細胞凋亡[13]。裂解的caspase-3將最終誘導腫瘤細胞中DNA片段化，因此剪切后的caspase-3是很多化合物抑制腫瘤生長增加腫瘤凋亡的關鍵靶點[14]。而caspase-3在caspase家族中被認為是最重要的執行蛋白，在細胞死亡過程中常會出現caspase-3激活。因此，測定caspase-3蛋白水平變化[15]，可以研究細胞凋亡機制。本實驗中使用不同濃度GP(10和20 mg·L-1)作用于胃癌細胞48 h，檢測胞內Bax、caspase-3和Bcl-2蛋白表達水平[16]，與對照組比較，GP在低濃度時就能夠使Bax和caspase-3表達水平增加，且呈現一定濃度依賴性，而Bcl-2蛋白變化與此相反[17]。

*P<0.05 vs control group.

圖2 Transwell 小室實驗檢測各組SGC 7901細胞穿膜細胞數

Fig.2 Number of transmembrane SGC 7901 cells in various groups detected by Transwell chamber assay

Lane 1:Control group;Lane 2-4:5,10,and 20 mg·L-1GP groups.

圖3 Western blotting法檢測各組SGC 7901細胞中Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表達電泳圖

Fig.3 Electrophoregram of expressions of Bcl-2, Bax and caspase-3 proteins in SGC 7901 cells in various groups detected by Western blotting method

*P<0.05, **P<0.01 vs control group.

圖4 Western blotting法檢測各組SGC 7901細胞中Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表達水平

Fig.4 Expression levels of Bcl-2, Bax, and caspase-3 proteins in SGC 7901 cells in various groups detected by Western blotting method

綜上所述，GP能夠上調Bax和caspase-3蛋白表達，下調Bcl-2蛋白表達，進而激活線粒體凋亡通路，誘導細胞凋亡[18]。本研究結果表明：GP對胃癌SCG 7901細胞具有明顯的增殖抑制作用，能夠誘導細胞凋亡，但其具體作用機制有待進一步研究。