低氧及其下游因子miRNA-145在臍帶間充質干細胞向Ⅱ型肺泡上皮細胞分化中的作用

石 旭, 余 欣，曲興龍，曹 揚，張廣娟，李長遠

(1. 吉林大學第一醫院檢驗科，吉林 長春 130021； 2.吉林大學第一醫院手足外科，吉林 長春 130021；3.吉林大學第一醫院呼吸內科，吉林 長春 130021；4.吉林大學第一醫院胸外科，吉林 長春 130021)

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是嚴重威脅人類健康的危重癥，可由嚴重肺部感染、外傷等多種因素誘發肺泡上皮細胞及毛細血管內皮細胞損傷，造成動脈血氧不足、水腫和氣體交換功能受損，引起嚴重的肺纖維化，最終導致急性呼吸功能不全或急性呼吸衰竭[1-2]。目前，針對肺泡上皮細胞損傷的修復尚缺乏有效的方法。干細胞是組織修復及功能重建領域中重要的“工具細胞”，目前已發現多種類型的間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSC)均可通過直接分化為Ⅱ型肺泡上皮細胞(type Ⅱ alveolar epithelial，ATⅡ)對肺損傷進行修復，降低肺損傷程度[3-4]，然而MSC分化的機制，尤其是損傷部位微環境對MSC分化的影響尚未明確。低氧是肺損傷組織中重要的微環境特征之一。McClendon等[5]發現：低氧誘導因子1(hypoxia-inducible factor 1，HIF-1)可通過促進MSC分化為ATⅡ從而促進肺損傷后修復；Ito等[6]證明：在低氧條件下下游靶基因STC1在ATⅡ中的高表達能夠增強肺泡上皮細胞傷口的修復。同時，轉化生長因子β(transforming growth factor β，TGF-β)則是肺損傷部位的另一個重要的微環境特征，其主要通過受體TGF-βRⅠ和TGF-βRⅡ傳遞信號，誘導及促進細胞纖維化[7-9]。有研究[10-11]報道：TGF-β信號通路在ALI發生后9 h便可被激活，而TGF-β刺激可使MSC向成肌纖維細胞分化。目前，MSC在低氧和TGF-β的雙重影響下是向ATⅡ分化還是向纖維細胞分化尚未見報道，其分化的調控機制有待進一步闡明。微小RNA(microRNA，miRNA)是17～24個核苷酸的非編碼RNA，可在轉錄后水平調節靶基因的mRNA翻譯。目前已有多項報道[12-13]表明：HIF-1能夠結合于miR-145啟動子區，上調其表達；同時，miR-145與TGF-β也密切相關，并在細胞纖維化及肌成纖維細胞分化過程中具有重要作用[14-15]。然而，miR-145在低氧誘導的MSC分化與纖維化間發揮何種調控作用尚未見報道。本研究在低氧條件下誘導人臍帶間充質干細胞(umbilical cord MSC，UCMSC)向ATⅡ分化，揭示低氧對UCMSC分化的影響，同時在低氧誘導分化過程中加入促細胞纖維化的TGF-β，探討在UCMSC分化過程中低氧對細胞纖維化的影響及其機制，為闡明UCMSC在損傷肺部微環境低氧和TGF-β的雙重刺激下向ATⅡ分化的機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑和主要儀器 DMED培養液、DMEM/F12培養液、胎牛血清、L-谷氨酰胺和雙抗均購自美國Gibco公司，重組人堿性成纖維細胞生長因子購自美國R&D公司，氯化鈷(cobaltous chloride，CoCl2)購自美國Sigma公司，anti-AQP5-PE和anti-SpC-FITC均購自美國BD公司，逆轉錄試劑盒(superscript Ⅱ reverse transcriptase)購自美國Invitrogen公司，Power SYBR Green Master Mix購自美國Applied Biosystems公司，miRNA 定量檢測試劑盒(All-in-One miRNA qRT-PCR Detection Kit)購自廣州復能基因公司，Ⅰ型膠原蛋白(Col-Ⅰ)、轉化生長因子βⅠ型受體(TGF-βRⅠ)和轉化生長因子βⅡ型受體(TGF-βRⅡ)一抗購自美國Abcam公司，Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3、HIF-1α一抗和辣根過氧化物酶標記的二抗均購自美國Santa Cruz公司，ECL化學發光試劑盒購自中國碧云天生物公司，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司。T25培養瓶和Transwell小室均購自美國康寧公司。AriaⅡ流式細胞儀購自美國BD公司，Ⅸ71熒光顯微鏡購自日本奧林巴斯公司，CFX96Touch實時熒光定量PCR儀購自美國Bio-RAD公司。

1.2 細胞培養 人UCMSC由本實驗室自足月剖宮產健康孕婦臍帶分離鑒定并保存，具體步驟：無菌條件下取新鮮臍帶約10 cm，生理鹽水漂洗后剪至長2～3 cm小段，再次漂洗，縱行剖開臍帶，剔除臍靜脈和臍動脈，取華爾通膠并剪碎成1 mm×1 mm ×1 mm左右的組織塊，將小組織塊鋪在培養皿中，加入含10%胎牛血清、2 mmol·L-1L-谷氨酰胺、1%雙抗的DMED培養液，置于5% CO2、37℃培養箱中靜置培養，待組織塊中爬出的成纖維樣細胞達到80%融合時收集細胞，隨后重懸并鋪入新的T25培養瓶，加入含10%胎牛血清、2 mmol·L-1L-谷氨酰胺、1%雙抗、10 μg·L-1重組人堿性成纖維細胞生長因子的DMEM/F12培養液繼續培養，待UCMSC生長至80%融合時傳代。人肺腺癌細胞株A549由本實驗室保存，復蘇后用含10%胎牛血清的DMED培養液培養，培養至對數生長期后與UCMSC共培養，誘導UCMSC向ATⅡ分化。

1.3 細胞分化 收集體外培養的UCMSC，調整細胞密度為1×104mL-1，在6孔板中加入1.5 mL單細胞懸液，待細胞貼壁后在每孔上放置Transwell小室，隨后在小室中放入1 mL DMEM培養液重懸的A549細胞(細胞密度為1×104mL-1)開始誘導分化，低氧誘導組則通過在誘導初始階段加入CoCl2模擬低氧環境來實現。每2 d進行1次細胞換液，在光鏡下觀察細胞形態，共培養8 d。

1.4 流式細胞術鑒定ATⅡ表型 收集體外誘導后獲得的肺泡上皮樣細胞，1 000 r·min-1離心10 min，洗滌后用100 μL PBS重懸細胞，分裝至流式管中，設置同型對照組和實驗組，在實驗組每個流式管中加入1 μL熒光標記抗體：anti-AQP5-PE和anti-SpC-FITC，混勻，室溫下避光孵育30 min，PBS洗滌2次后棄掉上清，1%多聚甲醛固定，24 h內用FACS Calibur流式細胞術檢測，通過Flowjo軟件分析目的細胞占收集細胞的百分比。

1.5 實時熒光定量PCR法檢測ATⅡ標志性基因 使用Trizol從誘導后細胞中提取總RNA，260 nm處測定樣品吸光度(A)值，對RNA進行定量，使用逆轉錄試劑盒Superscript Ⅱ reverse transcriptase獲得cDNA，隨后使用Power SYBR Green Master Mix對目的基因進行擴增，以GAPDH作為內參，使用2-ΔΔCt法計算目的基因mRNA相對于內參mRNA表達水平的變化倍數。所使用的基因的引物如表1所示。

1.6 miRNA定量分析miR-145表達水平 在提取總RNA后使用miRNA 定量檢測試劑盒(All-in-One miRNA qRT-PCR Detection Kit)檢測miR-145表達水平，以RNU6B作為內參基因，所有的樣本均分別對miRNA和U6進行擴增，每個樣本重復3次。miR-145-5p和RNU6B的引物均由美國GeneCopoeia公司設計并合成。

表1 RT-PCR引物序列和產物片段大小

Tab.1 Primer sequences and sizes of product fragments of RT-PCR

GenePrimer sequence (5'-3')Size(bp)HIF-1αF: ACCATGCCCCAGATTCAGGR: AGTGCTTCCATCGGAAGGACT261KGFF: TTGTGGCAATCAAAGGGGTGR: CCTCCGTTGTGTGTCCATTTA168CK18F: ATCTTGGTGATGCCTTGGACR: CCTGCTTCTGCTGGCTTAAT203SpAF: GTGATGGGATGACTGGAGCCR: TCTGAAGTCGTGGAGTGTGC199SpBF: ACAAGACTCTGACTGCCAGCR: CACACTTTTGCCTGTCCAGC215SpCF: AACGCCTTCTTATCGTGGTGR: AAGACTGGGGATGCTCTCTG178AQP5F: ATCTTCGCCTCCACTGACTCR: TTTCTTCTTTTCCCCCTTGG192Col-ⅠF: GGAAAGAATGGAGATGATGGR: CCAAACCACTGAAACCTCTG211TGFβRⅠF: TGATAAAACTTGCTCTGTCCACR: AATGGCTGGCTTTCCTTGG227TGFβRⅡF: TGGAGTTCAGCGAGCACTGTGR: TGTTGTGGTTGATGTTGTTG194Smad2F: ATGTCGTCCATCTTGCCATTCR: AACCGTCCTGTTTTCTTTAGCT210Smad3F: CCCCAGAGCAATATTCCAGAR: GACATCGGATTCGGGGATAG221GAPDHF: GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACAR: GTGGTCGTTGAGGGCAAT237

1.7 Western blotting法檢測纖維化相關蛋白表達水平 采用RIPA細胞裂解液冰上裂解收集的細胞，12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離總蛋白，并將其轉移到PVDF膜上，經5%脫脂牛奶室溫封閉10 min后，分別加入Col-Ⅰ、TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ、Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3和HIF-1α抗體，4℃緩慢搖動孵育過夜。次日，使用TBST沖洗膜后，再用對應的辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育2 h，經TBST充分漂洗后使用ECL化學發光試劑盒進行目的條帶顯色，掃描儀進行掃描，采用Image J軟件進行灰度值分析。按照公式計算蛋白表達水平：蛋白表達水平=每個樣本條帶灰度值/內參灰度值。

1.8 載體構建 應用PCR法擴增TGF-βRⅡ基因3′端非編碼區(3′-UTR)中miR-145可能的結合位點，選擇合適的酶切位點后克隆至pGL3熒光素酶報告基因載體上，構建pGL3-TGFβRⅡ野生型載體(pGL3-TGF-βRII WT)，同時通過PCR法對miR-145可能的結合位點進行點突變，構建pGL3-TGF-βRⅡ突變型載體(pGL3-TGFβRⅡMut)。miR-145-5p前體表達質粒(pre-145，5′-GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU-3′)及其無義序列對照質粒(scrambled control)均由美國GeneCopoeia公司設計并構建。miR-145抑制劑均由上海吉瑪制藥技術有限公司設計并合成。

1.9 雙熒光素酶報告基因檢測 利用Lipofectamine 2000將pre-145及其對照質粒分別與TGFβRⅡ報告基因質粒共轉染至293T細胞中，以海腎熒光素酶報告質粒作為內參，在轉染48 h后裂解細胞，用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測目的基因的相對熒光素酶活性(relative luciferase unit, RLU)。RLU=RLU1/RLU2，RLU1為螢火蟲熒光素酶反應強度，RLU2為內參海腎熒光素酶反應強度。

2 結 果

2.1 CoCl2處理后UCMSC中HIF-1α表達水平 用不同濃度CoCl2處理UCMSC 12 h，與常氧培養組比較，100 nmol·L-1CoCl2組中HIF-1α mRNA和蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)。用100 nmol·L-1CoCl2處理UCMSC不同時間：與常氧培養組比較，CoCl2處理6 h組中HIF-1α蛋白表達水平明顯上升(P<0.05)，而HIF-1α mRNA表達水平則無明顯改變(P>0.05)。UCMSC中HIF-1α表達水平與CoCl2處理呈時間-劑量依賴性。故本實驗選用100 nmol·L-1CoCl2模擬低氧環境。見表2。

2.2 低氧條件下UCMSC向ATⅡ的分化 在低氧條件下利用Transwell小室對UCMSC和A549細胞進行共培養，誘導4 d后UCMSC開始出現多角形形態改變；誘導8 d后細胞形態出現明顯改變，由成纖維樣變為鋪路石樣的上皮細胞。見圖1(插頁二)。經流式細胞術鑒定，低氧誘導后細胞ATⅠ標志性分子AQP5陽性表達率僅為(5.87±1.07)%，而ATⅡ標志性分子SpC陽性表達率為(94.5±3.37)%。見圖2。同時，與常氧條件下誘導分化的對照組比較，低氧條件下誘導分化細胞中KGF、CK18、SpA、SpB和SpC等ATⅡ特異性基因的表達水平明顯升高(P<0.05)，而2組間ATⅠ特異性基因AQP5的表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3。

表2 不同濃度CoCl2處理12 h后和100 nmol·L-1CoCl2處理不同時間后各組UCMSC中HIF-1α mRNA和蛋白表達水平

Tab.2 Expression levels of mRNA and protein of HIF-1α in UCMSC after treated with different concentrations of CoCl2for 12 h and treated with 100 nmol·L-1CoCl2for different time

GroupHIF-1α mRNAHIF-1α proteinTreatment with different concentrations of CoCl2 for 12 h 50 nmol·L-11.88±0.20 1.47±0.19 100 nmol·L-13.15±0.25*2.40±0.21* 200 nmol·L-13.75±0.80*3.42±0.42* 300 nmol·L-13.53±0.26*3.27±0.26*Treatment with 100 nmol·L-1 CoCl2 for different time 4 h1.43±0.12 1.31±0.16 6 h1.89±0.20 2.48±0.26△ 8 h2.82±0.16△2.77±0.17△ 12 h2.80±0.27△2.92±0.24△

*P<0.05 compared with 50 nmol·L-1group;△P<0.05 compared with 4 h group.

圖2 ATⅠ和ATⅡ表面標志性分子流式細胞術鑒定

Fig.2 Surface markers of ATⅠ and ATⅡ identificated with flow cytometry

2.3 低氧下TGF-β1下游纖維化相關基因的表達水平 在UCMSC向ATⅡ分化過程中加入5 μg·L-1TGF-β1處理，8 d后收集細胞，與常氧對照組比較，低氧組中細胞纖維化相關基因Col-Ⅰ及TGF-β1受體(TGF-βRⅠ和TGF-βRⅡ)mRNA表達水平均明顯下降(P<0.05)，Col-Ⅰ和TGF-βRⅡ蛋白表達水平也明顯下降(P<0.05)，TGF-βRⅠ蛋白表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05)；2組間TGF-β1下游因子Smad2和Smad3蛋白表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05)，但在低氧組中Smad2和Smad3蛋白磷酸化水平(p-Smad2和p-Smad3)與常氧對照組比較明顯下降(P<0.05)。見圖4。

*P<0.05 vs normoxic group;A: KGF; B: CK18; C: SpA; D: SpB; E: SpC; F: AQP5.

*P<0.05 vs normoxia group.

圖4 各組UCMSC中TGF-β下游纖維化相關基因mRNA(A)和蛋白(B)表達水平

Fig.4 Expression levels of mRNA (A) and protein (B) of TGF-β downstream fibrosis related-genes in UCMSC in various groups

2.4 低氧下miR-145表達水平及抑制miR-145后纖維化相關因子的表達水平 在低氧誘導UCMSC

向ATⅡ分化過程中miR-145表達水平呈逐漸上升趨勢，且在同一誘導時間點低氧組miR-145表達水平明顯高于常氧誘導組(P<0.05)。見圖5A。在低氧誘導UCMSC向ATⅡ分化過程中同時加入5 μg·L-1TGF-β1和miR-145抑制劑，8 d后收集細胞，與未加miR-145抑制劑的對照組比較，miR-145抑制劑組中Col-Ⅰ和TGF-βRⅡmRNA及蛋白表達水平均明顯升高(P<0.05)。見圖5B和C。

2.5 雙熒光素酶報告基因系統檢測miR-145與TGF-βRⅡ的結合 TGF-βRⅡ 3′-UTR區域含有2個miR-145-5p的結合位點，見圖6(插頁二)。與miR-145-5p的無義序列的對照質粒比較，miR-145-5p前體使TGF-βRⅡ 3′-UTR目的序列報告質粒的RLU明顯降低(P<0.05)，而miR-145-5p前體的突變體則對TGF-βRⅡ 3′-UTR目的序列報告質粒的RLU無明顯影響(P>0.05)。見圖7。

3 討 論

目前，人們認為ALI發病的初始階段是由內皮和上皮損傷引起的肺間質和肺泡水腫，水腫液中含有大量纖維蛋白、白蛋白、炎性細胞及其分泌的炎性因子，可促進成纖維細胞的增殖和細胞間黏附，導致異常的細胞外纖維蛋白沉積，最后漸進性發展成為不可逆的肺部纖維化，造成肺功能損傷[1-2]。因此，肺泡上皮細胞ATⅠ和ATⅡ的修復便成為ALI治療的一個重要方向。ATⅠ細胞覆蓋了肺泡95%的表面積，是進行氣體交換、吞飲微小粉塵和表面活性物質的重要部位；但ATⅠ細胞分化程度高、無增殖能力、不能更新修復，損傷后由ATⅡ增殖分化補充，研究者認為ATⅡ細胞是ATⅠ的前體細胞，因此在ALI發生時，ATⅡ的修復顯得尤為重要。

*P<0.05vsnormoxic group;△P<0.05vscontrol group;A: Expression level of miRNA-145; B: Expression levels of Col-Ⅰ and TGF-βRⅡ mRNA; C:Expression levels of Col-Ⅰ and TGF-βRⅡ proteins.

圖5 各組UCMSC中miR-145、Col-Ⅰ和TGF-βRⅡ表達水平

Fig.5 Expression levels of miR-145, Col-Ⅰ and TGF-βRⅡ in UCMSC in various groups

*P<0.05 vs pre-145 scramble group.

圖7 轉染miR-145前體后TGF-βRⅡ3′-UTR區RLU

Fig.7 RLU of TGF-βRⅡ-3′-UTR after transfection with pre-145-5p

大量研究[16-17]結果表明:MSC能夠在體外誘導分化為神經、心臟、肝臟和上皮等多種組織細胞，并且MSC的分化與其所在微環境有密切關聯。作為損傷肺部微環境的重要特征，低氧與高水平的TGF-β均對MSC的分化起重要的調控作用，但二者在UCMSC向ATⅡ分化過程中究竟發揮何種作用尚不明確。

MSC可通過與ATⅡ細胞共培養的方法在體外被誘導分化為ATⅡ樣細胞[4,18]。由于人肺腺癌細胞系A549與人Ⅱ型肺泡上皮細胞有相似特性，故A549被廣泛用于模擬ATⅡ細胞[19-20]。本實驗利用CoCl2競爭性結合HIF-1α的ODD區，從而抑制HIF-1α降解的特性[21]，在體外模擬低氧環境，在低氧條件下通過與A549共培養誘導UCMSC向ATⅡ分化。本研究結果表明：HIF-1α的表達與CoCl2處理劑量和時間成正相關關系，并且低氧條件誘導的細胞具有上皮細胞樣形態，同時高表達ATⅡ表面標志性分子SpC而低表達ATⅠ表面標志性分子AQP5，證明通過共培養的方式能夠在低氧條件下成功誘導UCMSC分化為ATⅡ。同時，本實驗還比較了常氧和低氧誘導組中ATⅡ特異性基因的表達，結果顯示：與常氧組比較，低氧組中ATⅡ特異性基因KGF、CK18、SpA、SpB和SpC表達水平明顯上升，而ATⅠ特異性基因AQP5則無明顯差異，表明低氧能夠促進UCMSC向ATⅡ分化。

高水平TGF-β1是損傷肺部微環境的重要因素，能夠誘導MSC向成纖維細胞分化[11]。為了研究TGF-β1和低氧二者同時存在對UCMSC分化的影響，本實驗在低氧誘導UCMSC向ATⅡ分化過程中加入TGF-β1刺激，結果顯示：與常氧對照組比較，低氧組中細胞纖維化相關基因Col-Ⅰ和TGF-βRⅡ在mRNA和蛋白水平上均明顯下調，而TGF-β1/TGF-βRⅡ通路下游p-Smad2和p-Smad3蛋白表達水平也明顯下調，表明低氧可通過下調TGF-βRⅡ表達來抑制TGF-β1/TGF-βRⅡ信號通路的活化以及纖維化關鍵因子Col-Ⅰ的表達，介導UCMSC對TGF-β1刺激耐受，從而抑制TGF-β1引起的組織纖維化。

為了研究低氧對TGF-βRⅡ表達的抑制作用，本實驗對與低氧密切相關的miRNA進行了分析。多項研究[12-13]顯示：低氧可通過結合于miR-145啟動子區上調其表達，而miR-145在細胞纖維化中也具有重要作用。Zhao等[14]發現：miR-145能夠下調平滑肌細胞中TGF-β下游細胞基質相關因子的表達水平；Yang等[15]發現：肺成纖維細胞中miR-145過表達可上調α-SMA，進而導致其向平滑肌細胞分化。本研究結果表明：在低氧誘導UCMSC分化為ATⅡ過程中，miR-145表達水平呈上升趨勢，并且在低氧組中的表達明顯高于同時間點的常氧組。隨后，為了驗證miR-145對TGF-βRⅡ的影響，本實驗在低氧誘導UCMSC向ATⅡ分化過程中同時加入TGF-β1和miR-145抑制劑，結果顯示：miR-145抑制劑能夠明顯上調Col-Ⅰ和TGF-βRⅡ表達水平。以上結果表明：低氧可通過miR-145負向調控TGF-βRⅡ表達，抑制TGF-β1/TGF-βRⅡ信號通路活化和纖維化關鍵因子Col-Ⅰ的表達，從而抑制UCMSC向成纖維細胞分化。

通過TargetScan數據庫進行生物信息學分析， TGF-βRⅡ基因3′-UTR區可能存在2個miR-145的結合位點，而Col-Ⅰ mRNA的3′末端區域則沒有miR-145的結合序列，因此miR-145并不直接抑制Col-Ⅰ表達。針對上述miR-145結合位點分別構建相應的熒光素酶報告質粒，利用雙熒光素酶報告基因系統檢測結果顯示：野生型miR-145-5p前體可明顯降低目的序列報告質粒的熒光素酶活性，表明miR-145-5p可與TGF-βRⅡ 3′-UTR區的兩段序列直接結合，從而介導TGF-βRⅡ的降解。

綜上所述，在UCMSC向ATⅡ分化過程中，低氧能夠通過直接上調miR-145降解TGF-βRⅡ，抑制TGF-β1/TGF-βRⅡ信號通路，介導UCMSC抵抗TGF-β1刺激，促進UCMSC向ATⅡ分化而抑制其向成纖維細胞分化。本研究闡明這一機制將為后續利用低氧相關miRNA治療肺損傷及促進損傷后修復提供理論依據。