白藜蘆醇對膠質瘤U87細胞上皮-間質轉化的抑制作用

趙麗艷，宋 揚，陳 勇，呂曉艷，賈茗博，李蘊潛

(1．吉林大學第二醫院檢驗科，吉林 長春 130041；2．吉林大學第一醫院神經外科，吉林 長春 130021)

惡性膠質瘤是高度惡性和高致死性的常見顱內腫瘤，最主要的生物學特性是侵襲性生長，是手術難以徹底切除、術后復發率高和預后不良的重要原因，這種侵襲性生長的機制尚未闡明。本課題組前期研究[1]表明：在一定條件下膠質瘤細胞能發生上皮-間質轉化(epithelial to mesenchymal transition, EMT)，EMT可能在膠質瘤侵襲性生長中起重要作用[2-3]。細胞EMT是一種由上皮細胞向間質細胞表型轉化的生物學過程，通過EMT，上皮細胞間的緊密連接缺失，細胞轉變為具有高遷移、高侵襲的間質細胞特征，是腫瘤侵襲、轉移、復發和治療抵抗的重要原因[4]。因此，抑制或逆轉腫瘤細胞EMT，已成為抗腫瘤治療的新靶標[5]。白藜蘆醇(resveratrol, Res)是一種具有多種生物活性的多酚化合物，研究[6]顯示：Res具有很強的抗腫瘤作用，但Res對膠質瘤細胞EMT影響的研究報道很少。本研究探討Res對膠質瘤細胞EMT的抑制作用，為改進膠質瘤的治療現狀提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器 人膠質母細胞瘤U87細胞購自美國ATCC細胞庫。DMEM培養基和胰酶-EDTA消化液為美國Gibco公司產品，胎牛血清(FBS)、青霉素、鏈霉素和四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自美國Sigma公司，TGF-β1購自美國Peprotech公司，Res購自美國ApexBio公司，Transwell小室和Matrigel基質膠為美國Corning公司產品，抗N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、抗β-連環蛋白(β-catenin)、抗波形蛋白(Vimentin)、抗Snail、抗基質金屬蛋白酶2(MMP-2)和抗基質金屬蛋白酶9(MMP-9)抗體購自美國Cell Signaling Technology公司(1∶1 000)，抗Twist1抗體(中國萬類生物公司)，RIPA細胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒和SDS蛋白上樣緩沖液(中國碧云天公司)，蛋白Marker(美國Thermo公司)，抗GAPDH抗體(美國Origene公司)。細胞培養箱和超凈工作臺(美國Thermo公司)，倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，電泳儀和轉膜儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 細胞培養及傳代 人膠質瘤U87細胞用含有10%FBS的DMEM培養基置于37℃、5% CO2的飽和濕度培養箱中培養。每2～3 d更換1次培養基，每3～5 d用胰酶消化后按1∶2～1∶3傳代，取處于對數生長期的細胞進行后續實驗。

1.3 Western blotting法檢測EMT標志物和轉錄因子表達水平 本研究組MTT法的預實驗結果顯示：Res終濃度在40 μmol·L-1及以下時對U87細胞的存活率影響不明顯，因此選擇40 μmol·L-1及以下濃度的Res進行后續實驗。取對數生長期U87細胞接種于10 cm細胞培養皿，細胞密度為每個培養皿5×105個細胞，37℃培養箱中培養，待細胞生長至70%～80%融合時，換無血清培養基饑餓細胞12 h，再加入終濃度為10×10-6g·L-1轉化生長因子β1(TGF-β1)(EMT組)，加入20 和40 μmol·L-1Res(Res處理組)，作用48 h后棄掉培養基，收集細胞，離心后棄去上清，加入RIPA裂解液提取細胞蛋白，并用BCA試劑盒進行蛋白定量。每孔加入30～50 μg蛋白，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉蛋白至PVDF膜上，室溫下用含5%脫脂奶粉的TBS封閉1 h，而后分別加入含有抗N-鈣黏蛋白、β-連環蛋白和波形蛋白，誘導EMT的轉錄因子Snail、Slug、Twist1、MMP-2、MMP-9和GAPDH一抗，4℃過夜孵育后洗膜，加入相應二抗孵育1～2 h后洗膜，加ECL顯色劑，在Sagecreation凝膠成像系統中顯影。采用AlphaEaseFC軟件分析目的條帶灰度值，以GAPDH為內參，目的條帶相對灰度值=目的條帶灰度值/GAPDH灰度值。以目的條帶相對灰度值表示蛋白表達水平。

1.4 劃痕愈合試驗檢測細胞遷移率 取對數生長期U87細胞接種于6孔板，每孔3×105個細胞，待細胞生長至70%～80%融合時，換用無血清培養基饑餓細胞12 h，再用含10×10-6g·L-1的TGF-β1無血清培養基誘導48 h后，用10 μL的槍頭尖在6孔板上平行劃痕，用PBS沖掉刮下的細胞，并在顯微鏡下測量劃痕的寬度(0 h)，換用含40 μmol·L-1Res的培養基培養24 h，測量劃痕寬度(24 h)。實驗重復3次。細胞的遷移能力以細胞遷移率表示：細胞遷移率=[(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度]×100%。

1.5 Transwell侵襲實驗檢測細胞侵襲率 Transwell小室(聚碳酸酯膜微孔徑8 μm)內加入稀釋的Matrigel 100 μL。將Transwell小室插入24孔板，37℃恒溫培養箱孵育24 h，使Matrigel在微孔濾膜上重組成基底膜結構。取對數生長期U87細胞接種于6孔板中，每孔3×105個細胞，用TGF-β1誘導細胞EMT(EMT組)及加入40 μmol·L-1Res(Res處理組)處理48 h后，消化細胞制備單細胞懸液)。取2.5×105mL-1細胞懸浮在200 μL無血清培養基，加入Transwell小室的上室面，每組設3個復孔，小室的下室內加入500 μL含10%FBS培養基作為趨化劑。置于恒溫細胞培養箱培養48 h后，取出Transwell小室，吸棄培養基，用棉簽擦去上室面未穿過膜的細胞，PBS清洗。4%多聚甲醛固定細胞后，0.1%結晶紫染色，將Transwell小室的濾膜取下，在顯微鏡下每個樣本隨機選取5個視野，計數每個視野內染色的細胞數量，即穿膜細胞數，拍照記錄實驗結果。藥物對細胞侵襲能力的影響以細胞侵襲率表示：細胞侵襲率=(處理組穿膜細胞數/對照組穿膜細胞數)×100%。

2 結 果

2.1 各組U87細胞間質標志物和轉錄因子蛋白表達水平 與對照組比較，EMT組膠質瘤U87細胞的間質標志物N-鈣黏蛋白、β-連環蛋白和波形蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)，轉錄因子Snail、Slug和Twist1蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)。與EMT組比較，Res處理組間質標志物N-鈣黏蛋白、β-連環蛋白和波形蛋白表達水平明顯降低(P<0.05或P<0.01)，轉錄因子Snail、Slug和Twist1蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)。40 μmol·L-1Res處理組上述指標變化較20 μmol·L-1Res處理組更明顯(P<0.05)。見圖1、表1和2。

2.2 各組U87細胞的遷移率 EMT組的細胞遷移率(68%±4%)明顯高于對照組(50%±5%,P<0.01)，而40 μmol·L-1Res處理組的細胞遷移率(37%±6%)較EMT組明顯降低(P<0.01)。見圖2和3。

Lane 1:Control group;Lane 2:EMT group;Lane 3:20 μmol·L-1Res treatment group;Lane 4:40 μmol·L-1Res treatment group.

圖1 各組膠質瘤U87細胞中間質標志物和轉錄因子表達電泳圖

Fig.1 Eleectrophoregram of expressions of mesenchymal markers and transcription factors in glioma U87 cells in various groups

表1 各組U87細胞中N-鈣黏蛋白、β-連環蛋白和波形蛋白表達水平

Tab.1 Expression levels of N-cadherin, β-catenin and Vimentin in glioma U87 cells in various groups (n=3,±s)

*P<0.05vscontrol group;△P<0.05,△△P<0.01vsEMT group;#P<0.05vs20 μmol·L-1Res treatment group.

表2 各組U87細胞中Snail、Slug和Twist1蛋白表達水平

Tab.2 Expression levels of Snail, Slug and Twist1 in glioma U87 cells in various groups (n=3,±s)

*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsEMT group;#P<0.05vs20 μmol·L-1Res treatment group.

A-C: 0 h; D-F: 24 h; A, D: Control group; B,E: EMT group; C,F: Res treatment group.

*P< 0.01 vs control group; △P< 0.01 vs EMT group.

Fig.3 Migration rates of glioma U87 cells in various groups

2.3 各組膠質瘤U87細胞的侵襲率 EMT組的細胞侵襲率(71%±5%)明顯高于對照組(45%±6%,P<0.01)，而40 μmol·L-1Res處理組細胞侵襲率(35%±5%)明顯低于EMT組(P<0.01)。見圖4(插頁二)和5。

*P< 0.01 vs Control group; △P< 0.01 vs EMT group.

Fig.5 Invasion rates of glioma U87 cells in various groups

2.4 各組膠質瘤U87細胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達水平 與對照組比較，EMT組U87細胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)；與EMT組比較，Res處理組MMP-2和MMP-9蛋白表達水平明顯降低(P<0.05或P<0.01)；與20 μmol·L-1Res處理組比較，40 μmol·L-1Res處理組U87細胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)。見圖6和表3。

Lane 1:Control group;Lane 2:EMT group;Lane 3:20 μmol·L-1Res treatment group;Lane 4:40 μmol·L-1Res treatment group.

圖6 Western blotting法檢測各組膠質瘤U87細胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達電泳圖

Fig.6 Electrophoregram of expressions of MMP-2 and MMP-9 proteins in glioma U87 cells in various groups detected with Western blotting method

表3 各組U87細胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達水平

Tab.3 Expression levels of MMP-2 and MMP-9 proteins in glioma U87 cells in various groups (n=3,±s)

*P<0.05vscontrol group;△P<0.05,△△P<0.01vsEMT group；#P<0.05vs20 μmol·L-1Res treatment group.

3 討 論

惡性膠質瘤的一個顯著特點是高度侵襲性生長，研發抑制侵襲性生長的藥物對提高膠質瘤的療效具有重要理論意義和應用價值。近年來越來越多的證據[7-8]表明：EMT在膠質瘤的侵襲性生長發生機制中起重要作用。上皮性腫瘤發生EMT時，上皮標志物E-鈣黏蛋白表達下調，而間質標志物表達上調，其中E-鈣黏蛋白表達下調是EMT最重要的改變[9]，即EMT過程中出現E-鈣黏蛋白向N-鈣黏蛋白的“鈣黏蛋白轉換(cadherin switch)”，已成為EMT最關鍵的標志[10]。然而，由于膠質瘤細胞缺少典型上皮細胞的特征，在大多數膠質瘤E-鈣黏蛋白不表達或表達水平很低[11]，不出現經典的“鈣黏蛋白轉換”[12]，因此有時把膠質瘤細胞EMT稱為上皮-間質轉化樣改變或過程。本研究未檢測E-鈣黏蛋白的表達。

本研究表明：在TGF-β1誘導下膠質瘤U87細胞的間質標志物N-鈣黏蛋白、β-連環蛋白和波形蛋白表達水平均明顯升高，顯示膠質瘤細胞發生EMT改變，進一步證明了本課題前期的研究結果[1]。近年來EMT抑制劑已成為抗癌藥物研究的重要方向[13]。Res是一種強效抗癌多酚類化合物。最近研究[14]顯示：Res一個新的抗癌作用是抑制腫瘤細胞EMT。在前列腺癌、肺癌和胰腺癌的研究[14-16]中已證明：Res能抑制或逆轉腫瘤細胞EMT，有效抑制腫瘤細胞的侵襲和轉移。本研究結果顯示：Res能明顯抑制膠質瘤U87細胞間質標志物N-鈣黏蛋白、β-連環蛋白和波形蛋白的表達，表明Res能抑制膠質瘤細胞EMT改變。

誘導EMT的轉錄因子(EMT-inducing transcription factors)主要包括Snail、Slug、Twist1和Zeb等，其通過不同信號通路下調上皮標志物的表達和抑制間質標志物(N-鈣黏蛋白和波形蛋白)的表達，從而誘導和激活EMT，參與腫瘤轉移[17]。本實驗結果顯示：在TGF-β1作用下，膠質瘤U87細胞中誘導EMT的轉錄因子Snail、Slug和Twist1蛋白的表達水平均升高，而Res處理能明顯抑制上述轉錄因子的表達，表明Res能抑制轉錄因子Snail、Slug和Twist1對膠質瘤細胞EMT的誘導作用，進一步證明Res能抑制膠質瘤細胞EMT。

經歷EMT的細胞最重要的行為改變是遷移和侵襲能力的增強。本研究結果顯示：發生EMT的U87細胞遷移率明顯增強，而Res處理可使細胞的遷移率明顯降低，表明Res可以抑制膠質瘤細胞EMT引起的細胞遷移能力。本研究Transwell侵襲實驗結果顯示：EMT組的U87細胞穿過人工基膜的細胞數較對照組明顯增多，細胞侵襲率增加，說明誘導EMT使膠質瘤細胞的侵襲能力增強，而Res處理組穿膜的細胞數量明顯減少，細胞侵襲率明顯降低，表明Res可以抑制膠質瘤細胞EMT誘導的細胞侵襲能力。

基膜是腫瘤的天然組織學屏障，基膜降解是腫瘤侵襲的關鍵環節。MMP-2和MMP-9又稱明膠酶或Ⅳ型膠原酶，通過降解基膜主要成分Ⅳ型膠原影響腫瘤的侵襲和轉移[18]。最近報道[19-23]顯示：Res能明顯抑制人膀胱癌細胞和人乳腺癌細胞MMP-2和MMP-9表達。本研究結果顯示：EMT組膠質瘤細胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達水平明顯上調，而Res處理組膠質瘤細胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達水平明顯降低。上述研究結果表明：Res能抑制膠質瘤細胞EMT引起的MMP-2和MMP-9蛋白表達上調，進一步證明Res能抑制膠質瘤細胞的侵襲能力。

綜上所述，Res能抑制膠質瘤U87細胞EMT，降低細胞遷移和侵襲能力，抑制MMP-2和MMP-9表達水平，提示Res是抑制膠質瘤侵襲性生長的重要候選藥物。Res抑制膠質瘤細胞EMT具有重要臨床意義，因為EMT不僅在腫瘤細胞的侵襲和轉移過程中起重要作用，而且還能促使腫瘤細胞獲得干細胞特性[21-23]。Res可以作為雙抑制劑，既抑制腫瘤細胞侵襲和轉移，又抑制經EMT產生的干細胞樣細胞，對包括膠質瘤在內的腫瘤的治療具有重要價值。