楊梅黃酮對小鼠腦膠質瘤GL261細胞增殖和凋亡的影響

邢樹剛，張麗紅，金明華，李百慧，武則馨，房 波，李 偉

(1.吉林大學基礎醫學院病理學系 病理生物學教育部重點實驗室，吉林 長春130021； 2.吉林大學公共衛生學院衛生檢驗學教研室，吉林 長春 130021)

膠質瘤是中樞神經系統最常見的原發性惡性腫瘤，目前主要治療方法是手術切除輔以放化療。手術切除后腫瘤常易復發，常用的化療藥物有卡莫司汀和替硝唑胺等，上述這些化療藥物雖然取得了一定的治療效果，但由于藥物本身存在的不良反應及部分膠質瘤的耐藥性，使膠質瘤的治療和預后難以取得理想效果[1-2]，因此尋找更有效且不良反應少的藥物成為膠質瘤治療的研究重點。楊梅黃酮(Myricetin)是從植物中提取的一種化學物，其來源廣泛、毒性低、不良反應少，并且對基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteases, MMPs)具有高效的特異性抑制作用[3-6]。目前已有研究證實楊梅黃酮對上皮源性惡性腫瘤如食管癌、非小細胞肺癌、結直腸癌、乳腺癌和肝癌等[7-13]以及實驗動物骨肉瘤[14]均有一定的抑制作用，但其作用機制目前尚不明確，迄今為止尚無將其應用于膠質瘤治療學的研究。本實驗擬通過體外實驗研究楊梅黃酮對小鼠腦膠質瘤GL261細胞的抑制作用，為進一步闡明其對腦膠質瘤的治療作用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 細胞和主要試劑 小鼠膠質瘤GL261細胞由吉林大學病理生物學教育部重點實驗室提供；楊梅黃酮購自美國Sigma公司，Matrigel購自美國BD公司，RPMI-1640培養基及胎牛血清購自美國Gibco公司，CCK-8 Kit購自日本同仁公司，Hoechst 33342購自北京碧云天生物技術有限公司，Annexin Ⅴ/PI凋亡檢測試劑盒購自天津三箭生物技術有限公司。

1.2 CCK8實驗檢測細胞活性 GL261細胞選用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基，置于37℃、5% CO2孵箱中培養。取對數生長期的GL261細胞，以1×105mL-1細胞密度接種于96孔板中，置37℃、5% CO2孵箱中培養24 h后，棄上清液，加入不同濃度楊梅黃酮(濃度梯度為10、20、30、40、50和60 μmol·L-1)，同時設對照組，各組均設4個復孔，分別于24 和48 h各取出一塊培養板，每孔加入10 μL CCK-8溶液，避光孵育1～2 h，觀察培養基顏色變化，用酶標儀在450 nm波長處檢測每孔的吸光度(A)值，計算每孔細胞存活率。細胞存活率=處理組A值/對照組A值×100%。

1.3 流式細胞術檢測細胞周期 取對數生長期GL261細胞，調整細胞密度為1×106mL-1，接種于6孔板，待細胞融合至80%時，加含40 μmol·L-1楊梅黃酮的新鮮培養基繼續培養24 h后，設對照組，收取單細胞懸液，用預冷的PBS洗2次，70%乙醇固定，5 μL RNA酶A(10 g·L-1)，37℃孵育30 min，加入25 μL PI染色液(1 g·L-1)，4℃避光孵育30 min，流式細胞儀檢測細胞周期。

1.4 Hoechst 33342染色及結果判定標準 調整細胞密度為1×105mL-1，24孔板中每孔加入500 μL單細胞懸液，待細胞融合度達80%時，取出培養板，棄去培養基，加入含有不同濃度(30、40和50 μmol·L-1)楊梅黃酮的新鮮培養基，并設置相應的溶劑平行對照。然后加入200 μL Hoechst 33342(1∶2 000稀釋)染液，室溫孵育。熒光顯微鏡下任取5個視野照相，觀察凋亡細胞核形態。凋亡的細胞核固縮、深染，核內可見濃染致密的顆粒塊狀熒光。

1.5 流式細胞術檢測細胞凋亡 取對數生長期的GL261細胞，調整細胞密度至1×106mL-1，接種于6孔板，待細胞融合至80%時，加入含有不同濃度(0、30、40和50 μmol·L-1)楊梅黃酮的新鮮培養基，繼續培養24 h后，Annexin Ⅴ-FITC與PI匹配標記細胞，流式細胞術檢測細胞凋亡率。凋亡結果判斷：正?；罴毎鸄nnexinⅤ(-)、PI(-)；早期凋亡細胞AnnexinⅤ(+)、PI(-)；晚期凋亡細胞或壞死細胞AnnexinⅤ(+)、PI(+)。細胞凋亡率=(早期凋亡細胞數+晚期或壞死細胞數)/總細胞數×100%。

1.6 Transwell法檢測細胞遷移能力 GL261細胞用無血清培養基重懸，調整細胞密度為1×106mL-1，將小室放入24孔板中，接種50 μL單細胞懸液，并用無血清培養基將體積補充至200 μL，分別在上室和下室加入楊梅黃酮(0、5、10和20 μmol·L-1)，繼續培養12 h后，下室面細胞甲醇固定20 min，PBS清洗，置于含有0.1%結晶紫的孔中染色15～20 min，倒置顯微鏡觀察，于400倍視野下任取5個不重復視野照相并計數穿膜細胞數。

1.7 Transwell法檢測細胞侵襲 將Matrigel至4℃冰箱預溶解，無血清培養基1∶3稀釋，混勻后60 μL每孔加至小室上室聚碳酸酯膜(孔徑8 μm)，37℃孵育30 min，取對數生長期的GL261細胞，調整細胞密度為1×105mL-1，將小室放入含有10%血清及新鮮培養基的24孔板中，接種單細胞懸液，分別在上室和下室加入楊梅黃酮(0、5、10和20 μmol·L-1)，12 h后下室面細胞甲醇固定20 min，PBS清洗，置于含有0.1%結晶紫的孔中染色15～20 min，倒置顯微鏡下觀察，于400倍視野下任取5個不重復視野照相并計數。

1.8 RT-PCR法檢測MMP-2、MMP-9和MMP-14 mRNA表達水平 Trizol法提取楊梅黃酮(0、5和10 μmol·L-1)處理的GL261細胞總RNA，核酸蛋白測定儀檢測RNA濃度，逆轉錄反應條件為：42℃、30 min，99℃、5 min，5℃、5 min。PCR引物序列：GAPDH 正義鏈，5′-TGTTGCCATCAATGACCCCTT-3′， 反義鏈，5′-CTCCACGACGTACTCAGCG-3′； 小鼠MMP-2 正義鏈，5′-CAAGTTCCCCGGCGATGTC-3′， 反義鏈，5′-TTCTGGTCAAGGTCACCTGTC-3′； MMP-9 正義鏈，5′-GCAGAGGCATACTTGTACCG-3′， 反義鏈，5′-TGATGTTATGATGGTCCCACTTG-3′； MMP-14 正義鏈，5′-CAGTATGGCTACCTACCTCCAG-3′， 反義鏈，5′-GCCTTGCCTGTCACTTGTAAA-3′。PCR反應體系：94℃預變性3 min；94℃、30 s，55℃～60℃、30 s，72℃、30 s，32個循環；72℃終延伸10 min；1.5%瓊脂糖凝膠電泳，觀察各條帶并照相，利用凝膠成像系統分析各條帶灰度值。

2 結 果

2.1 各組GL261細胞的存活率 20、30、40、50和60 μmol·L-1楊梅黃酮組在24和48 h時細胞存活率較對照組均明顯下降(P<0.01)，且呈時間-劑量依賴性。見表1。

表1 各組GL261細胞存活率

*P<0.01 compared with control group.

2.2 各組GL261細胞的細胞周期 與對照組比較，40 μmol·L-1楊梅黃酮組GL261細胞G1期比例升高(P<0.05)，S期比例降低(P<0.05)。見圖1。

圖1 流式細胞術檢測各組GL261細胞周期

2.3 各組GL261細胞凋亡情況 Hoechst 33342染色結果：與對照組比較，楊梅黃酮組GL261細胞出現典型的凋亡形態改變，出現凋亡小體。并且隨藥物濃度的增加，凋亡小體的比例也隨之增加，見圖2(插頁二)。進一步通過流式細胞術AnnexinⅤ/PI熒光雙染法檢測楊梅黃酮對GL261細胞的凋亡誘導作用。與對照組比較，30、40和50 μmol·L-1楊梅黃酮組早期凋亡和晚期凋亡的細胞比例均增加(P<0.05或P<0.01)，并且隨藥物濃度的增加，晚期凋亡的細胞比例有增加的趨勢。見圖3和4。

A：Control group；B-D：30,40,and 50 μmol·L-1 myricetin groups.

*P<0.05，**P<0.01 compared with 0 mol·L-1Myricetin.

圖4 流式細胞術檢測各組GL261細胞凋亡率

Fig.4 Apoptotic rates fo GL261 cells in various groups detected by flow cytometry

2.4 各組GL261細胞遷移的細胞數目和侵襲率 與對照組比較，5、10和20 μmol·L-1楊梅黃酮組GL261細胞遷移率明顯降低(P<0.05或P<0.01)，并隨楊梅黃酮濃度的增加，GL261細胞遷移率呈遞減的趨勢，見圖5(插頁二)和圖6。進一步通過包被Matrigel的 Transwell小室檢測GL261細胞的侵襲能力，與對照組比較，楊梅黃酮組GL261細胞侵襲率明顯降低(P<0.05或P<0.01)，且隨著楊梅黃酮濃度的增加，GL261細胞侵襲率逐漸減少。見圖7(插頁三)和圖8。

*P<0.05**P<0.01 vs 0 μmol·L-1 myricetin(control) group.

2.5 各組GL261細胞中MMP-2、MMP-9和MMP-14 mRNA表達水平 與對照組比較，楊梅黃酮5和10 μmol·L-1組MMP-2與MMP-9 mRNA的表達水平均降低(P<0.05或P<0.01)，MMP-14 mRNA表達水平無明顯變化(P>0.05)。見表2和圖9。

3 討 論

楊梅黃酮廣泛存在于自然界的各種植物中，已有研究證實其具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、保護神經元和抑制血栓形成等多種功能[15-20]。近年來楊酶黃酮在腫瘤治療中的作用越來越引起研究者的關注。目前已有研究[7-10]證實：楊梅黃酮對肺癌、肝癌、食管癌和皮膚癌等均有一定的治療作用，但其在腦膠質瘤中的作用及其相關機制尚不清楚。

*P<0.05，**P<0.01 vs 0 μmol·L-1 myricetin(control group).

Lane 1,4,7,10: 10 μmol·L-1myricetin group;Lane 2,5,8,11: 5 μmol·L-1myricetin group;Lane 3,6,9,12: Control group;M:Marker.

圖9 各組GL261細胞中MMPs mRNA表達電泳圖

Fig.9 Electrophoregram of MMPs mRNA expressions in GL261 cells in various groups

表2 各組GL261細胞中MMPs mRNA表達水平

*P<0.05,**P<0.01 compared with control group.

促進增殖和抑制凋亡是導致腫瘤細胞惡性增殖的2個重要因素。為研究楊梅黃酮對膠質瘤增殖和凋亡的影響，本研究首先應用CCK-8實驗以及流式細胞術檢測楊梅黃酮對膠質瘤細胞GL261增殖的影響，結果顯示：楊梅黃酮能抑制GL261細胞的活性，并呈時間-劑量依賴性；細胞周期分析證實楊梅黃酮通過將細胞周期阻滯于G1期抑制膠質瘤細胞的分裂增殖；通過Hoechst 33342 染色形態學觀察可見楊梅黃酮可導致細胞凋亡小體增多；流式細胞術對早期凋亡和晚期凋亡的細胞計數結果顯示：楊梅黃酮可增加細胞凋亡率。由以上結果本文作者推測：楊梅黃酮對膠質瘤細胞的抑制作用通過抑制增殖和促進凋亡雙重機制來完成。有研究[12]顯示：楊梅黃酮可將肝癌細胞HepG2細胞周期阻滯于G2/M期，并證實其誘導肝癌細胞的凋亡機制可能是通過線粒體凋亡途徑以及Akt/p70s6k1/Bad信號通路進行的；有研究[13]還顯示：楊梅黃酮通過降低ERK1/2以及Cycline D1的水平將細胞周期阻滯于G1期。Maggioni等[7]的研究也證實：楊梅黃酮可通過下調鱗狀細胞癌SCC-25細胞Cycline D1的表達將細胞周期阻滯于G1期。上述研究結果與本實驗結果一致，并為本課題組進一步研究楊梅黃酮調控膠質瘤增殖和凋亡的相關信號通路及其機制提供一定理論依據。

惡性腫瘤的一個重要生物學特征是局部浸潤和轉移，細胞外基質和基底膜的降解是腫瘤侵襲和轉移的關鍵環節。MMPs是目前已知的能降解細胞外基質的關鍵酶。本文作者通過酶動力學實驗證實楊梅黃酮對MMP-2、MMP-9和MMP-14具有特異性抑制作用。本研究首先利用Transwell小室檢測GL261細胞在楊梅黃酮作用下的遷移及侵襲能力，結果顯示：楊梅黃酮可抑制 GL261細胞的遷移；進而在Transwell小室內包被Matrigel用以模仿體內細胞外基質，結果表明：楊梅黃酮可降低穿透Matrigel的細胞比例，因此本文作者認為楊梅黃酮可降低膠質瘤細胞的侵襲能力。

為進一步明確楊梅黃酮是否通過抑制MMPs從而降低GL261細胞的遷移及侵襲能力，本研究應用RT-PCR法檢測MMP-2、MMP-9和MMP-14 mRNA 的表達水平，結果表明：在楊梅黃酮的作用下，GL261細胞MMP-2和MMP-9 mRNA的表達水平明顯降低。MMP-2和MMP-9又稱明膠酶、Ⅳ型膠原酶，其主要功能是降解基底膜的主要成分Ⅳ型、Ⅴ型和Ⅵ膠原，腫瘤細胞的基底膜是腫瘤的天然組織學屏障，基底膜降解是腫瘤侵襲的關鍵環節[21-22]。有研究[8]顯示：楊梅黃酮可抑制肺癌A549細胞 MMP-2的表達及活性。Jung等[5]通過應用楊梅黃酮治療經紫外線照射的小鼠發現：楊梅黃酮可抑制紫外線誘導的MMP-9的表達及酶活性。由此本文作者認為：楊梅黃酮可通過降低MMP-2和MMP-9的表達抑制膠質瘤細胞的遷移及侵襲。MMP-14屬膜型基質蛋白酶，又名MT1-MMP，其在惡性腫瘤進展及腫瘤血管生成中發揮重要作用[23]。本研究結果顯示：經楊梅黃酮處理后MMP-14 mRNA的表達無明顯影響，提示其在楊梅黃酮促進膠質瘤侵襲中未發揮作用。

綜上所述，楊梅黃酮可在體外抑制小鼠膠質瘤GL261細胞的增殖，促進其凋亡，并通過抑制MMP-2和MMP-9的表達抑制膠質瘤細胞的遷移和侵襲。上述作用的相關信號通路、機制以及楊梅黃酮在膠質瘤生長和轉移中的作用有待進一步通過體內實驗研究證實。