磷酸化胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶在小鼠海馬發(fā)育過程中的表達(dá)及其意義

王天月，崔曉燕，吳 驍， 王 丹

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院血液科,遼寧 錦州121001;2.河北省藥品檢驗(yàn)研究院藥理毒理室,河北 石家莊 050011;3.遼寧何氏醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,遼寧 沈陽(yáng) 110163;4. 錦州醫(yī)科大學(xué)人體解剖與組織胚胎學(xué)教研室,遼寧 錦州121001)

海馬屬邊緣系統(tǒng)，主要包括阿蒙角(Ammon’s horn，CA)和齒狀回 (dentate gyrus, DG)等結(jié)構(gòu)，在空間定位、學(xué)習(xí)記憶和控制情緒等過程中發(fā)揮著重要作用[1-2]，成為神經(jīng)科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于MAPK(mitogen activated protein kinase，MAPK)家族下游成員。無活性的ERK位于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)胞外信號(hào)引起ERK磷酸化(pERK)激活后，則從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核中，從而觸動(dòng)一系列下游基因的活化[3]。研究[4-6]表明：ERK信號(hào)通路激活可直接參與細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞存活，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)海馬神經(jīng)細(xì)胞增殖,是細(xì)胞生長(zhǎng)周期環(huán)中不可或缺的過程。近年來，有關(guān)ERK的研究多集中在促進(jìn)細(xì)胞增殖及其介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)具體機(jī)制、建立在各種動(dòng)物和細(xì)胞模型基礎(chǔ)上的關(guān)于ERK在神經(jīng)系統(tǒng)退行性與功能失調(diào)性疾病以及孤獨(dú)癥模型、神經(jīng)毒性和母嬰分離等方面[7-10]；但ERK表達(dá)在腦發(fā)育不同階段的變化規(guī)律及其機(jī)制研究較少。因此，本研究利用免疫組織化學(xué)和免疫印跡法、結(jié)合圖像分析技術(shù)觀察胚胎 (embryo, E) 18 d以及生后 (postnatal, P) 1、3、7、14、21和28 d時(shí)小鼠海馬組織中pERK表達(dá)變化，為在分子水平探究海馬發(fā)育機(jī)制提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及標(biāo)本制備[11]8周齡昆明小鼠由錦州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(遼)2014-0004，以雌雄比例1∶2飼養(yǎng)，按日觀察，見陰道栓出現(xiàn)為E 0 d，仔鼠出生的最早時(shí)間為P 0 d。取E 18 d的胎鼠和P 1、3、7、14、21和28 d的小鼠海馬組織，4%多聚甲醛固定，常規(guī)制備光鏡標(biāo)本，連續(xù)切片，切片厚度5 μm，用于免疫組織化學(xué)顯色。另低溫下取各時(shí)間點(diǎn)的小鼠海馬組織，-80℃保存，用于免疫印跡檢測(cè)。

1.2 主要試劑 S-P超敏試劑盒和DAB試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，兔抗小鼠多克隆pCREB抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公司，ECL試劑盒購(gòu)自上海 BestBio公司，蛋白Marker和PVDF膜購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，BCA 試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所，β-actin購(gòu)自亞太恒信生物工程有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色 石蠟切片經(jīng)脫蠟、透明至水化后，滴加過氧化物酶，室溫15 min；高壓修復(fù)3 min，室溫冷卻，非免疫動(dòng)物血清封閉15 min；兔抗小鼠pERK抗體 (1∶100) 4℃孵育過夜；生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG (1∶200)，37℃孵育20 min； 鏈霉素抗生物素-過氧化物酶工作液37℃孵育10 min； DAB-H2O2顯色；蘇木精復(fù)染；常規(guī)脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察。用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.4 免疫印跡法檢測(cè)小鼠海馬組織中pERK蛋白表達(dá)水平 按1∶5比例于海馬組織加入蛋白裂解液，充分反應(yīng)后離心10 min，采用 BCA 試劑盒檢測(cè)上清液蛋白濃度。各泳道加入 50 μg 的蛋白量,電泳分離；冰浴轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后加入pERK抗體(1∶1 000)，4℃孵育過夜；TBST漂洗；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(1∶5 000)，室溫震蕩孵育 2 h，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)檢測(cè)蛋白條帶，將條帶掃描后用 Photoshop 7.0 軟件進(jìn)行處理。內(nèi)參β-actin。掃描X射線片，計(jì)算機(jī)處理，應(yīng)用公式計(jì)算A值，A值=-lgT，T為透光率，A值越大，表示密度越大，表達(dá)水平越高。

1.5 圖像分析 各取5張不同樣本切片，系統(tǒng)、隨機(jī)選擇400倍光鏡視野3個(gè)，所得圖像結(jié)果利用圖像分析軟件(Image-Pro Plus 6.0)進(jìn)行分析，應(yīng)用公式計(jì)算A值，A=-lgT，T為透光率，A值越大，表示密度越大，表達(dá)越強(qiáng)。

2 結(jié) 果

2.1 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)小鼠海馬組織中pERK蛋白表達(dá)水平 免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示：pERK陽(yáng)性產(chǎn)物呈棕黃色顆粒狀，主要在海馬DG顆粒細(xì)胞層和CA錐體細(xì)胞層神經(jīng)元的細(xì)胞核中表達(dá)。E 18 d，海馬DG和CA區(qū)pERK表達(dá)染色淺，排列稀疏，吸光度很低；E 18 d～P 7 d，pERK染色逐漸加深、密集，吸光度逐漸增加，與其他6個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較，P 7 d吸光度最高(F=34.537,P<0.01)。P 14 d～P 21 d，pERK染色逐漸變淺，密集程度逐漸降低，吸光度逐漸下降(F=28.754,P<0.01)；P 28 d處于穩(wěn)定的較低水平(F=6.075,P>0.05)(圖1，見插頁(yè)三)。

2.2 免疫印跡法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)小鼠海馬組織中pERK表達(dá)水平 免疫印跡法檢測(cè)圖像分析結(jié)果：各時(shí)間點(diǎn)均有pERK表達(dá)，E 18 d～P 7 d，pERK表達(dá)水平逐漸升高，P 7 d時(shí)pERK表達(dá)水平最高，與其他6個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=33.856,P<0.01)；P 14～21 d時(shí)pERK表達(dá)水平逐漸降低，與P 7 d 比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=22.627,P<0.01)；P 28 d時(shí)PERK表達(dá)處于穩(wěn)定的較低水平(F=7.421,P>0.05)。見表1。

表1 不同發(fā)育時(shí)期小鼠海馬組織DG及CA區(qū)pERK表達(dá)的表達(dá)水平

Tab.1 Expression levels of pERK in DG and CA regions of hippocampus tissue of mice at different development stages (n=6,±s)

*P<0.01vsthe pre-time point.

3 討 論

海馬結(jié)構(gòu)于胚胎時(shí)期發(fā)生，起自位于端腦泡背內(nèi)側(cè)，呈 “S”形結(jié)構(gòu)的海馬原基。大鼠海馬原基于E 14 d形成，小鼠則為E 12 d，此后進(jìn)入海馬的有序發(fā)育過程，即胚胎早、中期速度較慢，于末期和生后早期階段發(fā)育明顯增速，表現(xiàn)為海馬體積以及各層的厚度明顯增加，海馬變成C字形，能區(qū)分CA和DG結(jié)構(gòu)正常大小[12],海馬的這些顯著變化均離不開活躍的細(xì)胞增殖活動(dòng)。

ERK是與細(xì)胞增殖有關(guān)的重要基因之一，盧瑛等[13]研究發(fā)現(xiàn)：抵抗素能通過上調(diào)人血管平滑肌細(xì)胞ERK的磷酸化水平，促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖，應(yīng)用ERK特異性抑制劑能顯著降低ERK的磷酸化水平，細(xì)胞增殖受抑。研究[14-15]顯示：ERK磷酸化后進(jìn)入細(xì)胞核，激活相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的活性，進(jìn)而調(diào)節(jié)促進(jìn)細(xì)胞周期由G1期向S期過渡的基因表達(dá)，包括即刻早期基因和遲發(fā)反應(yīng)基因，參與細(xì)胞分化與增殖的調(diào)控。Oliveros等[6]和佟雷等[16]研究發(fā)現(xiàn)：新生大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖與ERK有關(guān)。ERK 信號(hào)通路抑制劑可以抑制神經(jīng)細(xì)胞自噬，加重蛛網(wǎng)膜下腔出血的早期腦損傷和急性缺血性腦梗死再灌注損傷[17-19]。

Palmer等[20]認(rèn)為：成體海馬結(jié)構(gòu)中的神經(jīng)發(fā)生源于齒狀回的亞顆粒細(xì)胞層,其位于顆粒細(xì)胞層和門區(qū)間的一個(gè)狹窄區(qū)域，大多數(shù)神經(jīng)細(xì)胞增殖發(fā)生于此。本研究中免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：pERK主要在DG顆粒細(xì)胞層和CA錐體細(xì)胞層神經(jīng)元的細(xì)胞核中表達(dá)，與上述研究結(jié)論一致，即pERK主要位于細(xì)胞核并參與細(xì)胞增殖。

Bayer[21]研究表明：大鼠生后1周為DG增殖分化遷移高峰，P 14 d ～ 2月呈下降趨勢(shì)，推測(cè)生后1周為大鼠海馬細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和結(jié)構(gòu)構(gòu)建的關(guān)鍵時(shí)期。本研究結(jié)果顯示：表達(dá)pERK的陽(yáng)性細(xì)胞變化趨勢(shì)是在E 18 d～P 7 d逐階段增加，P 7 d時(shí)達(dá)高峰，隨后的P 14～21 d階段 pERK陽(yáng)性細(xì)胞逐漸稀疏，A值降低，P 28 d時(shí)處于穩(wěn)定的較低水平。本研究結(jié)果表明：pERK的變化趨勢(shì)與以往報(bào)道的海馬神經(jīng)細(xì)胞增殖的變化趨勢(shì)的文獻(xiàn)相符[12,21]。出現(xiàn)這種變化趨勢(shì)的原因在于：小鼠出生是機(jī)體的一大轉(zhuǎn)折, 外界環(huán)境的聲和光等刺激可能使ERK自身活化，轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，進(jìn)而激活下游轉(zhuǎn)錄因子，產(chǎn)生細(xì)胞增殖效應(yīng)。發(fā)育早期，即E 18 d～P 7 d，是海馬塑型的關(guān)鍵時(shí)期，海馬首先形成了DG和CA區(qū)雛形，并且各區(qū)開始分層，為了滿足海馬結(jié)構(gòu)在形態(tài)及體積上出現(xiàn)的巨大改變，必然引起海馬神經(jīng)細(xì)胞大量增殖，因此，pERK陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)在P 7 d達(dá)到最高峰。在海馬結(jié)構(gòu)發(fā)育晚期，即P 14～21 d及以后階段，海馬結(jié)構(gòu)和功能日趨成熟，此時(shí)不再需要細(xì)胞的大量增殖分化，促使與細(xì)胞快速增殖有關(guān)的ERK表達(dá)逐漸下降，細(xì)胞增殖速度放慢，新生細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，直至P 28 d達(dá)穩(wěn)態(tài)。

綜上所述，pERK參與了海馬神經(jīng)元的增殖，與海馬發(fā)育有關(guān)聯(lián)，本研究結(jié)果為從分子水平闡明海馬發(fā)育的機(jī)制提供了較為詳實(shí)的實(shí)驗(yàn)資料。但海馬神經(jīng)細(xì)胞增殖受多種因素和多途徑動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)，因此海馬發(fā)育的具體機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。