過表達miR-124a對J774.1細胞中TNF-α和IL-6表達水平及細胞周期的影響

尹芳蕊，龐春艷，耿立霞，王永福

(包頭醫學院第一附屬醫院風濕免疫科 包頭醫學院風濕免疫研究所 內蒙古自治區自體免疫學重點實驗室，內蒙古 包頭014010)

類風濕性關節炎(rheumatid arthritis,RA)是慢性炎癥性自身免疫性疾病，影響約世界1%人口，是造成傷殘的最普遍原因之一，但迄今為止 RA 病因和發病機制尚未完全明確，被認為是遺傳、免疫和環境相互作用的結果[1-2]。免疫系統中巨噬細胞、樹突狀細胞、肥大細胞和NK細胞失調發生在RA的不同階段，在其發展過程中具有重要意義，早期RA 可無典型癥狀或僅呈現出單一臨床癥狀，且缺乏特異性診斷方法，探尋靈敏度高、特異度好的早期診斷標志物和特異的治療靶點是 RA 診斷治療的最終目標[3]。微小RNA(microRNA, miRNA )是非編碼小分子 RNA， miRNA與機體的免疫調節密切相關，多種 miRNA 在RA中異常表達[4-6]，與 RA 的發生、發展、預后和轉歸關系密切，檢測 與RA 有關的 miRNA 譜，可為 RA 的早期診斷提供新的依據，為 RA 的治療提供新的選擇[7]。人類miR-124的3個編碼基因位于8q12.3、8p23.1和20q13.33，miR-124的表達異常可誘發多種疾病產生及發展。miR-124 高度保守，在腦和脊髓神經元中大量表達，目前研究多集中在其與神經和腦疾病的相關性方面。miR-124a可促進神經元的分化[8]，是一種腦神經保護和腦功能恢復的新的生物標志物[9]。研究[10-11]表明：miR-124可抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移，促進腫瘤細胞的凋亡。

miR-124與風濕病的相關研究國內外少見報道。Nakamachi等[12]研究發現：miR-124可抑制佐劑性關節炎鼠模型的關節炎癥狀，減少滑膜細胞增殖、白細胞浸潤、軟骨或骨破壞，用pre-miR-124處理后佐劑性關節炎鼠模型的破骨細胞計數及核因子κB受體激活因子配體(receptor activator of nuclear factor κB ligand，RANKL)、整合素β1(integrin β1，ITGB1)和核因子活化的T細胞的細胞質(activated T cells cytoplasmic 1，ATc1)表達水平均降低。

以上研究在動物水平驗證了miR-124可改善佐劑性關節炎鼠模型臨床癥狀，抑制關節炎的發展，但miR-124與RA細胞水平的研究尚未見報道。本研究從細胞水平設計通過miRNA-124a的過表達腺病毒載體，感染RA細胞模型小鼠巨噬細胞J774.1，探討miRNA-124a對小鼠巨噬細胞J774.1的可能作用機制，以期為RA的治療提供細胞水平的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 細胞株、主要試劑和儀器 J774.1細胞株購自上海軒研生物科技有限公司，過表達miR-124a的腺病毒液和miR-124a腺病毒陰性對照液購自武漢淅瑪公司，白細胞介素6(IL-6)及腫瘤壞死因子α(TNF-α) ELISA試劑盒購自上海生物工程有限責任公司，胎牛血清、胰蛋白酶和DMEM培養液購自美國Gibco公司，反轉錄試劑盒、Trizol和熒光定量試劑盒購自日本 TaKaRa 公司，熒光顯微鏡購自日本Olympus公司，酶標分析儀購自深圳雷杜生命科學股份有限公司，熒光定量 PCR 儀購自中國 BIOER公司，FACSCantoⅡ流式細胞儀購自美國BD公司。

1.2 細胞培養及miRNA轉染 J774.1巨噬細胞用含100 mL·L-1FBS的DMEM/F12 培養基培養。將生長狀態良好的J774.1細胞，胰酶消化培養，取對數生長期細胞，以每毫升1×106個細胞均勻接種于培養皿，當細胞融合度達到60%時進行轉染，細胞實驗分為3組，即miR-124a過表達組(感染miR-124a腺病毒載體)、空載腺病毒組(感染陰性病毒液)和空白對照組(不做任何處理)，設置3個復皿，感染48 h后在倒置顯微鏡的熒光視野和明視野下觀察細胞感染狀態，流式細胞儀檢測感染效率，感染效率=感染陽性細胞數/檢測總細胞數×100%。

1.3 ELISA法檢測細胞上清液中IL-6 和TNF-α水平 上述3組感染48 h后的細胞上清液按IL-6和TNF-α檢測試劑盒的說明書進行操作，檢測IL-6和TNF-α的表達水平。加樣，37℃溫育30 min，洗滌5次，加酶標抗體50 μL，溫育、 洗滌，加顯色液顯色，檢測其吸光度(A)值，根據標準曲線計算出IL-6和TNF-α的水平。

1.4 RT-PCR法檢測細胞中IL-6 和TNF-α mRNA表達水平 3組細胞感染48 h后，棄除培養液，PBS清洗2次，用 Trizol 法提取上述3組細胞的總RNA，反轉錄試劑盒將 RNA反轉錄合成cDNA，RT-PCR法檢測IL-6和TNF-α mRNA的相對表達水平，引物由上海生工生物有限公司合成。根據Ct值采用 2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達水平，ΔCt=目的基因Ct值-內參基因Ct值，ΔΔCt=實驗組Ct值-對照組Ct值。

1.5 流式細胞術檢測細胞周期 收集3組樣本細胞制成單細胞懸液，細胞數量為每毫升2×106個細胞，75%冰凍乙醇4 ℃過夜，重懸細胞后加入20 μL RNA酶，37℃水浴30 min，加入400 μL碘化丙啶(PI)進行DNA染色，輕輕混勻后4℃避光孵育60 min，使用BD流式細胞儀檢測，每組進行3次獨立重復實驗，實驗數據用 ModFit LT軟件進行分析。

2 結 果

2.1 熒光顯微鏡下觀察miR-124a過表達腺病毒感染J774.1細胞 miR-124a過表達腺病毒感染J774.1細胞48 h后，應用熒光顯微鏡觀察可見細胞發出綠色熒光，表明腺病毒成功有效地感染J774.1細胞(圖1，見插頁三)。

2.2 流式細胞儀檢測3組細胞感染48 h后的感染效率 3組細胞感染48 h后，胰酶消化并收集，流式細胞儀分析腺病毒感染J774.1細胞的效率，結果顯示：空白對照組、miR-124a過表達組和空載腺病毒組感染效率分別為42.8%和45.1%。見圖2。

A: Blank control group B:Empty vector group C:miR-124a group.

Fig.2 Infection efficiencies of J774.1 cells in various groups detected by flow cytometry

2.3 ELISA法檢測3組細胞感染48 h后細胞上清中TNF-α和IL-6水平 3組細胞感染48 h后，ELISA法檢測結果顯示：miR-124a過表組細胞上清中TNF-α和IL-6水平明顯低于空白對照組和空載腺病毒組(P=0.038，P=0.042；P=0.043，P=0.044)。見表1。

表1 3組細胞上清中TNF-α和IL-6水平

Tab.1 Levels of TNF-α and IL-6 in cell supernatant in three groups [n=3,±s,ρB/(ng·L-1)]

*P<0.05vsblank control group;△P<0.05vsempty vector group.

2.4 RT-PCR法檢測3組細胞中TNF-α和IL-6 mRNA表達水平 3組細胞感染48 h后，RT-PCR法檢測TNF-α和IL-6 mRNA表達水平：miR-124a過表達組細胞中TNF-α和IL-6 mRNA表達水平明顯低于空白對照組和空載腺病毒組(P=0.001，P=0.002；P=0.001，P=0.003)。見表2。

2.5 流式細胞術檢測3組細胞感染48 h后不同細胞周期的細胞百分率 miR-124a腺病毒轉染J774.1細胞48 h，與空白對照組和空載腺病毒組比較，miR-124a過表達組G1期細胞百分率明顯升高(P<0.01)，S和G2期細胞百分率明顯降低(P<0.01)，表明miR-124a感染小鼠巨噬細胞 J774.1 細胞后可以阻滯細胞周期于G1期。見表3。

表2 3組細胞中TNF-α和IL-6 mRNA表達水平

Tab.2 Expression levels of TNF-α and IL-6 mRNA in cells in three groups (n=3,±s)

*P<0.05vsblank control group;△P<0.05vsempty vector group.

表3 3組不同細胞周期細胞百分率

Tab.3 Percentages of cells at different cell cycles in three groups (n=3,±s,η/%)

*P<0.05vsblank control group;△P<0.05vsempty vector group.

3 討 論

RA是慢性侵蝕性關節炎為特征的全身性自身免疫病，病變特點為關節滑膜炎癥、骨侵蝕和關節破壞日益嚴重，最后導致程度不等的功能障礙和畸形，病因至今仍未闡明，免疫失衡和過度炎癥可能是RA發病的核心環節。近年來研究[13-14]顯示：輔助性T淋巴細胞和巨噬細胞及其分泌的細胞因子可侵蝕破壞關節，巨噬細胞作為一種炎癥細胞，能夠產生高濃度的細胞因子和促炎介質，從而加重炎癥反應，最終導致關節破壞;巨噬細胞為RA的起始細胞，巨噬細胞的損傷和激活會引起機體炎癥性反應。小鼠巨噬細胞J774.1具有正常巨噬細胞功能，可以產生TNF-α和IL-6[15]。因此本研究選擇小鼠巨噬細胞J774.1作為RA研究的載體。體內的Th1/Th2 輔助T細胞及其分泌的細胞因子在體內維持機體的免疫自穩，Th1細胞主要分泌 IFN-γ和TNF-α 等細胞因子，Th2細胞分泌 IL-4和IL-6等細胞因子，然而在RA發生發展過程中這種平衡被破壞[16]。其中IL-6和TNF-α等重要促炎性細胞因子參與RA多種致病機制，人源化IL-6受體拮抗劑可以改善RA患者癥狀[17-18]。

miRNAs可通過調節炎性細胞因子表達而減緩RA臨床癥狀，Yang 等[19]研究顯示：miR-124參與膽堿能抗炎通路，對全身和局部炎癥有明顯的抑制作用，α7煙堿型乙酰膽堿受體 (alph α7 nicotinic acetylcholine receptors, α7nAChR)通過調節 miR-124 的表達，減少了IL-6 和TNF-α 的產生和釋放，miR-124通過靶蛋白 STAT3 來減弱 IL-6的產生，通過降低TNF-α轉化酶穩定性來調節 TNF-α蛋白表達。Qiu等[20]發現：miR-124是1個重要的炎癥相關miRNA，miR-124可抑制TLR通路中IL-1受體相關激酶1 (IL-1 receptor-associated kinase 1) 和TNF 受體相關因子6(TNF receptor associated factor 6)，發揮抗炎作用。王易林等[21]發現：在脂多糖誘導的小鼠急性肺損傷模型上，活化的過氧化物酶增殖體激活受體γ(peroxisome proliferators activated receptor γ，PPARγ) 通過上調miR-124 抑制小鼠肺組織炎性因子 IL-6和TNF-α 的表達，具有保護和防御急性肺損傷的作用。本研究結果顯示：小鼠巨噬細胞J774.1細胞感染48 h后，miR-124a過表達組細胞上清中TNF-α和IL-6表達水平明顯低于空白對照組和空載腺病毒組，細胞中TNF-α 和IL-6 mRNA表達水平明顯低于空白對照組和空載腺病毒組,提示過表達的miR-124可以抑制RA細胞模型J774.1細胞炎性因子TNF-α和IL-6的釋放,從而減緩RA的病情迅速進展。

本實驗采用腺病毒感染J774.1細胞48 h后，采用流式細胞術檢測miR-124a腺病毒轉染J774.1細胞48 h后各組細胞的周期分布：miR-124a過表達組G1期細胞百分率與空載腺病毒組和空白對照組比較明顯升高，S和G2期細胞百分率明顯降低，提示miR-124a轉染小鼠巨噬細胞J774.1細胞后可以阻滯細胞周期于G1期，miR-124a可能通過影響細胞周期的方式影響J774.1細胞的增殖。Nakamachi等[22]將miR-124a的前體轉染RA患者滑膜細胞后可以抑制其增殖，并阻滯細胞周期于G1期，miR-124a結合在細胞周期激酶2(cyclin-dependent kinase 2，CDK-2) 和 單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1)的3′端的非編碼區，抑制CDK-2和MCP-1的表達。

綜上所述，miR-124a抑制RA致病過程中重要炎癥介質IL-6和TNF- α的分泌，并影響RA常用的細胞模型J774.1 細胞的增殖，在此推測miR-124a在RA發病中可能起著正調控作用，可能成為RA新的治療靶點，但目前對其作用機制了解尚少，還需進一步深入探討。