杞菊地黃丸對青光眼模型大鼠視網膜結構的保護作用及其機制

趙 燕，張 新，張 劍，田石琦，常英霞

(1.河北醫科大學第一附屬醫院眼科，河北 石家莊 050081；2.佳木斯大學附屬第一醫院眼科，黑龍江 佳木斯 154002)

青光眼是僅次于白內障的第二大致盲眼病，嚴重威脅著人眼的視力健康，眼內壓力呈現間斷性或者持續性升高是其發病過程中的主要因素[1-2]。研究[3-4]表明：視網膜神經節細胞凋亡是導致青光眼的發病機制之一。因此，通過藥物有效抑制視網膜神經節細胞凋亡是治療青光眼的一個重要靶點。杞菊地黃丸具有滋補肝腎、益精養血明目的功效。研究[5]表明：玄府閉塞和精血不足是導致青光眼視神經損害的主要病機，以開通玄府和益氣活血的方法作為青光眼視神經保護的首要治則。目前國內外尚未見有關杞菊地黃丸對視網膜神經保護機制研究的報道，因此，本研究通過觀察杞菊地黃丸對高眼壓大鼠模型視網膜神經節細胞中B淋巴細胞瘤2(Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bax)及含胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(caspase-3) mRNA和蛋白表達的影響，探討杞菊地黃丸對青光眼視網膜神經的保護作用及其相關機制，旨在為研究杞菊地黃丸對視網膜神經細胞損傷的保護作用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器 雌性SD大鼠50只，10～12周齡，體質量180～220 g，購于河北醫科大學實驗動物學部，動物合格證號：SYXK(冀)2013-0023。適應性飼養1周，飼養溫度22℃～25℃，相對濕度55%～72%。杞菊地黃丸(北京同仁堂科技發展股份有限公司制藥廠)，山羊抗大鼠Bcl-2、山羊抗大鼠Bax和兔抗大鼠caspase-3(美國Santa Cruz公司)。Tonolab動物眼壓計(芬蘭愛科公司)，HM 355S石蠟切片機(美國賽默飛世爾科技有限公司)，DS-Ri2顯微成像系統(日本尼康公司)，ABI Veriti96 PCR儀(美國應用生物系統公司)，Powerpac Univeal電泳儀和VersaDoc凝膠成像系統(美國伯樂公司)。

1.2 青光眼大鼠模型制備和實驗動物分組 50只SD大鼠隨機分為空白對照組，模型組，低、中和高劑量杞菊地黃丸組；除空白對照組外，其余各組大鼠采用烙閉上鞏膜靜脈法進行單眼造模[6]。以10%水合氯醛(0. 4 mL·100 g-1)腹腔注射，麻醉，將奧布卡因滴眼液(4 g·L-1)滴入雙眼結膜囊內，使雙眼表面麻醉。以右眼為對照眼，左眼為實驗眼，將大鼠頭部置于裂隙燈顯微鏡頭架處，用532二極管激光行左眼270°角膜緣血管網和角膜緣顳上、顳下3條淺層鞏膜靜脈血管光凝，雙眼滴入諾氟沙星滴眼液，隔日在裂隙燈顯微鏡下觀察結膜的充血情況以及角膜水腫情況，測量雙眼的眼壓，若左眼眼壓高于右眼眼壓10 mmHg表示造模成功。藥物劑量按成人給藥劑量采用體表面積換算，低、中和高劑量杞菊地黃丸組分別灌胃給予劑量為1、2和4 g·kg-1的杞菊地黃丸，空白對照組和模型組大鼠分別口服給予等體積生理鹽水，每天1次。

1.3 大鼠眼壓檢測 于給藥12周后，以0.5%鹽酸丙美卡因滴眼液表面麻醉后，采用眼壓計檢測眼壓，連續檢測3次取平均值。

1.4 組織切片制備和HE染色 于給藥12周后處死大鼠，立即摘除眼球(含球后視神經2 mm)，角膜貫穿一小切口, 于15%甲醛組織固定液中浸泡24 h，沿視神經連線對剖眼球，去除眼前節和玻璃體，梯度脫水、透明、石蠟包埋，切片(4 μm)。蒸餾水洗滌，采用蘇木素染色10 min，沖洗后，于10 g·L-1鹽酸乙醇分化30 s，于蒸餾水中浸泡15 min，伊紅復染5 min，采用不同濃度乙醇梯度脫水，二甲苯洗滌1 min，中性樹脂封固，顯微鏡下觀察眼球組織形態表現。

1.5 TUNEL法檢測視網膜神經節細胞凋亡指數 分離視網膜在內的后半部分眼杯，于15%甲醛組織固定液中浸泡，4℃固定24 h，梯度脫水、透明、包埋、切片。采用40 g·L-1多聚甲醛/免疫染色固定溶液染色15 min，滴入20 mg·L-1蛋白酶K工作液，室溫孵育10 min，40 g·L-1多聚甲醛固定5 min，100 μL平衡液8 min，滴加反應液并于濕盒中孵育1 h，37℃，避光，終止反應，KPBS洗滌，滴入DAPI染液，孵育15 min，封片。于光學顯微鏡下，每張切片隨機選取6個視野，觀察視網膜神經節細胞凋亡情況，正常視網膜神經節細胞核呈藍色，凋亡細胞核呈棕褐色，分別計數每個視野中陽性著色細胞數，計算出視網膜神經節細胞的凋亡指數，取平均值。凋亡指數計算公式：凋亡指數=陽性細胞數/總細胞數×100%。

1.6 RT-PCR法檢測大鼠視網膜組織中Bcl-2、Bax和caspase-3 mRNA表達水平 取各組大鼠視網膜組織，按照Trizol說明書提取總RNA，逆轉錄合成cDNA，采用PCR儀進行擴增，所用引物序列：Bcl-2，上游引物5′-TTCTTTGAGTTCGGTGGGGTC-3′，下游引物5′-TTCTTTGAGTTCGGTGGGGTC-3′；Bax，上游引物5′-TCCACCAAGAAGCTGAGCGAG-3′，下游引物5′-GTCCAGCCCATGATGGTTCT-3′； caspase-3，上游引物5′-TGGAGAGAAGATGGTTTGAGC-3′，下游引物5′-CCCTATTGCTGGATGCTTTC-3′；GAPD，上游引物5′-GATGCTGGTGCTGAGTATGCCG-3′，下游引物5′-GTGGTGCAGGATGC-3′。擴增條件：92℃、30 s，65℃、30 s，72℃、54 s，共 32個循環；74℃延伸3 min。所得結果直接在熒光定量操作系統中進行比較分析，分別以Bcl-2、Bax和caspase-3 mRNA條帶與GAPD條帶的灰度比值表示mRNA表達水平，測定平均值。

1.7 免疫組織化學法檢測大鼠視網組織中Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表達水平 取大鼠視網膜組織切片，采用免疫組織化學法染色，使用Motic圖像系統進行圖像處理，每張切片取 4個視野，每個視野面積為0.2 mm×0.2 mm。測定吸光度(A)值，對陽性染色細胞予以半定量分析，以A值表示視網膜組織中Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表達水平。

2 結 果

2.1 各組大鼠眼壓 與空白對照組比較，模型組大鼠眼壓明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，低、中和高劑量杞菊地黃丸組大鼠眼壓明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠眼壓

*P<0.05 compared with blank control group；△P<0.05 compared with model group.

2.2 各組大鼠視網膜組織形態表現 空白對照組大鼠視網膜神經纖維排列整齊，神經節細胞間隙清楚。模型組大鼠視網膜神經纖維排列不整齊，纖維間質水腫，細胞層呈空泡樣，視網膜神經節細胞數目明顯減少。低劑量杞菊地黃丸組大鼠視神經纖維排列不整齊，纖維間質部分水腫，偶見空泡。中劑量杞菊地黃丸組大鼠細胞形態大致正常。高劑量杞菊地黃丸組大鼠眼視網膜神經節細胞數目多于模型組。低和中劑量杞菊地黃丸組大鼠眼視網膜神經纖維細胞排列整齊，神經節細胞形態正常。見圖1(插頁三)。

2.3 各組視網膜神經節細胞凋亡指數 與空白對照組比較，模型組大鼠視網膜神經節細胞凋亡指數明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，低、中和高劑量杞菊地黃丸組大鼠視網膜神經節細胞凋亡指數明顯降低(P<0.05)。見表2和圖2(插頁三)。

2.4 各組大鼠視網膜組織中Bcl-2、Bax和caspase-3 mRNA表達水平 與空白對照組比較，模型組大鼠視網膜組織中Bcl-2 mRNA、Bax和caspase-3 mRNA表達水平明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，低、中和高劑量杞菊地黃丸組大鼠Bcl-2 mRNA表達水平明顯升高(P<0.05)，Bax和caspase-3 mRNA表達水平明顯降低(P<0.05)。見圖3和表3。

表2 各組大鼠視網膜神經節細胞凋亡指數

Tab.2 Apoptotic indexes of retinal ganglion cells in various groups (n=10,±s,η/%)

*P<0.05 compared with blank control group；△P<0.05 compared with model group.

2.5 各組大鼠視網膜組織中Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表達水平 與空白對照組比較，模型組大鼠Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，低、中和高劑量杞菊地黃丸組大鼠Bcl-2蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)，Bax和caspase-3蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)。見圖4(插頁四)和表4。

Lane 1:Blank control group; Lane 2: Model group; Lane 3-5: Low, medium, and high doses of Qijudihuang Pill groups.

圖3 各組大鼠視網膜組織中Bcl-2、Bax和caspase-3 mRNA表達電泳圖

Fig.3 Electrophoregram of expressions of Bcl-2, Bax and caspase-3 mRNA in retina tissue of rats in various groups

表3 各組大鼠視網膜組織中Bcl-2、Bax和caspase-3 mRNA表達水平

*P<0.05 compared with blank control group；△P<0.05 compared with model group.

表4 各組大鼠視網膜組織中Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表達水平

*P<0.05 compared with blank control group；△P<0.05 compared with model group.

3 討 論

研究[7]認為：青光眼屬五風內障，五風內障主要由于玄府閉塞、經脈不利、珠內氣血津液不行和神水瘀積所致。臨床上主要通過滋養肝腎、活血化瘀的方法作為中醫的基本治則防治青光眼視神經損害[8-9]。杞菊地黃丸由枸杞子、菊花、熟地黃、山茱萸、牡丹皮、山藥、茯苓和澤瀉組成，方中熟地黃補血養陰、填精益髓；山茱萸補益肝腎、斂陰；澤瀉利水滲濕，泄熱，兼防熟地滋膩；茯苓健脾利水；牡丹皮，清熱涼血、活血祛瘀。以上6種中藥共同配伍，起補肝腎活性的作用。菊花清熱解毒，清疏上焦頭目風熱，利于滋養陰精；枸杞子滋補肝腎、益精明目。菊花、枸杞子二者均入肝經，具有滋陰養肝、明目的功效。

視網膜神經節細胞是構成視網膜神經元的主要細胞，青光眼的發生常伴隨視網膜神經節細胞凋亡，該過程不可逆，其凋亡程度通常作為治療青光眼藥物療效的評價指標[10-12]。機體細胞凋亡過程受到Bcl-2、Bax和caspase-3等多種基因調控[13]。Bcl-2可抑制細胞凋亡，Bax是凋亡促進基因，二者在細胞凋亡調控過程中是相互對立的一對調控基因[13-15]。caspase-3是凋亡途徑的共同下游部分，直接促使細胞凋亡[16-17]。Bcl-2和Bax為caspase-3的上游調控機制，Bcl-2和Bax的表達能調節外環境誘發的caspase-3的激活和調亡；caspase-3亦可作為Bcl-2和Bax的上游調控機制。近年來研究[18-20]顯示：Bcl-2、Bax可作為caspase-3的直接底物而作用于caspase-3的下游，加速凋亡的發生。

本研究組織病理學結果表明：模型組大鼠視網膜結構不完整，神經纖維排列不整齊，纖維間質水腫且可見空泡，視網膜神經節細胞數量減少，低、中和高劑量杞菊地黃丸組大鼠視網膜組織神經均得到不同程度改善，說明杞菊地黃丸可以減輕青光眼視網膜損傷；TUNEL檢測結果表明：杞菊地黃丸可有效減少青光眼模型大鼠視網膜神經節細胞凋亡；此外，模型組大鼠視網膜神經節細胞中Bcl-2 mRNA和蛋白表達水平有所升高，Bax和caspase-3 mRNA及蛋白表達水平明顯提高。本研究結果表明：杞菊地黃丸可通過抑制網膜神經節細胞的凋亡，調控Bcl-2、Bax和caspase-3 mRNA及蛋白的表達水平，對青光眼大鼠的視網膜起保護作用。