膽總管結扎致肝纖維化模型大鼠肝臟內源性AcSDKP及其調控因子水平的變化

白 潔，紀文靜，丁永年，彭媛媛，陳源文

(1.新疆醫科大學第二附屬醫院消化內科，新疆 烏魯木齊830028；2.上海交通大學醫學院附屬新華醫院消化內科，上海200092)

N-乙酰基-絲氨酰-天門冬酰-賴氨酰-脯氨酸(N-acetyl-seryl-aspartyl-lysylproline, AcSDKP)是1種內源性乙?；碾幕衔铮淝绑w胸腺素β4通過脯氨酸寡肽酶(prolyl oligopeptidase，POP)水解生成，胸腺素β4-POP-AcSDKP軸廣泛存于哺乳動物多種器官與體液中[1]。研究[2]證實:AcSDKP具有多種重要生物學功能，其中對心臟、腎臟等重要器官的纖維化或重塑具有較強的抑制作用。近年研究[3]顯示：肝纖維化發生發展過程中AcSDKP起著極為重要的效應，在肝細胞外基質沉積以及肝損傷修復等方面具有重要調控作用。目前研究[4]證實：血管緊張素轉換酶(angiotensin converting enzyme，ACE) 是內源性AcSDKP特異性水解酶，在體內外均有極強的AcSDKP水解活性。目前這些調控作用的具體機制尚不清楚，因此也是臨床研究的熱點問題之一。肝纖維化動物模型較多，其中膽總管結扎肝纖維化模型是應用較為普遍的方法之一，因此本研究選擇膽總管結扎制備大鼠肝纖維化模型，分析肝纖維化模型大鼠內源性AcSDKP的動態變化以及其調節因素的改變情況，以期為臨床治療肝纖維化提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器 普通級4周齡健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠45只，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，體質量(190±18)g，動物合格證號：SCXK(京)2012-0001；均予以動物食用標準飼料，維系12 h光照的晝夜周期，且本研究對動物處置方法符合上海交通大學醫學院附屬新華醫院倫理委員會要求。Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、Ⅳ型膠原(CⅣ)和透明質酸(HA)試劑盒均購自上海信裕生物技術有限公司，AcSDKP檢測ELISA試劑盒購自法國BIO公司。RM2255型號石蠟切片機購自德國萊卡公司，Multi-analyst Software凝膠圖像分析處理軟件購自美國Gel公司，AU5800型自動生化分析儀購自美國貝克曼公司。

1.2 實驗動物分組 按照隨機數字表法將45只SD大鼠分為3組，每組15只：模型組，采用膽總管結扎建立肝纖維化動物模型；阻斷組，大鼠予以血管緊張素轉化酶抑制劑(ACEI)卡托普利(40 mg·kg-1)每天灌胃1次，連續灌胃8周，再采用膽總管結扎建立肝纖維化動物模型；對照組，予以開腹，但不結扎膽總管。3組大鼠的周齡、體質量、飲食以及大小便等因素比較差異均無統計學意義 (P>0.05)，具有可比性。

1.3 肝纖維化動物模型的建立 SD大鼠正常適應性喂養1周后，自尾靜脈內注射苯巴比妥2 mg·kg-1，消毒后開腹，分離膽總管并予以結扎，再逐步關腹，術后予以常規喂養，本研究中所有大鼠肝纖維化實驗模型均通過肝臟病理檢查證實造模建立成功[5]。3組大鼠均分別在1、2和4周后各處死5只動物。

1.4 肝功能和纖維化指標檢測 3組大鼠均在處死前經下腔靜脈采集靜脈血，以3 000 r·min-1離心后，收集上層血清標本，保存在-20℃冰箱中待檢查。應用自動生化分析儀檢測血清樣本中丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、總膽紅素(TB)和白蛋白(ALB)水平。應用放射免疫法測定血清樣本中PCⅢ、CⅣ和HA水平。

1.5 肝纖維化組織病理學觀察 肝組織標本分為2份，一份肝組織置于液氮冷凍后，-80℃冰箱中保存，采用ELISA法檢測肝臟組織樣本中AcSDKP水平；另一份肝組織置于10%緩沖甲醛中固定24 h，石蠟包埋，組織病理切片層厚4 μm，HE染色，評估肝臟肝組織纖維化及重構情況。

1.6 胸腺素β4、POP和ACE蛋白表達水平檢測 應用Western blotting法半定量分析檢測3組大鼠肝組織中胸腺素β4、POP和ACE蛋白表達水平，并比較1、2和4周時間點上述3種指標動態變化。實驗具體步驟：取0.5 g冰凍肝組織置于4℃的組織勻漿緩沖液中勻漿，12 000 r·min-1高速離心15 min，取上清液，樣品的蛋白濃度按Bradford法以牛血清白蛋白(BSA)為標準測定，根據標準曲線推算出樣品的蛋白濃度。然后取100 μg總蛋白沸水浴10 min后進行10%SDS-PAGE電泳，以β-actin為內參。電泳結束后進行Western blotting法檢測，應用Gel公司的Multi-analyst Software軟件進行吸光度(A)值定量分析，結果以目的蛋白條帶與內參蛋白條帶A值的比值表示，以確定胸腺素β4、POP和ACE蛋白表達水平。

2 結 果

2.1 各組大鼠肝功能指標 第1～4周，模型組大鼠血清中ALT、AST和TB水平高于其他2組(P<0.05)，而阻斷組與對照組上述指標比較差異無統計學意義(P>0.05)。第2～4周，模型組大鼠血清中ALB和AcSDKP水平低于其他2組(P<0.05)，而阻斷組和對照組上述指標比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2 各組大鼠肝纖維化指標 第1～4周，3組大鼠肝組織中PCⅢ、CⅣ和HA水平比較差異無統計學意義(P>0.05)；第2～4周，模型組PCⅢ、CⅣ和HA水平高于其他2組(P<0.05)，而阻斷組和對照組上述各指標比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

2.3 各組大鼠肝組織病理形態表現 第1周，各組大鼠肝細胞和肝組織結構完整、基本正常，無明顯壞死細胞及炎性細胞浸潤、纖維組織增生現象。第2周，模型組大鼠肝組織呈現小灶狀壞死，小葉結構基本完整，匯管區呈現少量纖維增生以及炎性細胞浸潤，肝細胞大量發生脂肪變性；對照組及阻斷組大鼠肝細胞和肝組織基本正常。第4周，模型組大鼠肝組織呈片狀壞死，肝小葉破壞，結構紊亂，假小葉，匯管區擴大，較多炎性細胞浸潤，大量纖維組織增生，肝細胞脂肪變性程度更加嚴重；對照組和阻斷組肝細胞及肝組織基本正常。見圖1(插頁四)。

2.4 各組大鼠肝組織中胸腺素β4、POP和ACE蛋白表達水平 第2周開始，模型組大鼠肝組織中胸腺素β4及ACE水平高于其他2組，而POP水平低于其他2組(P<0.05)；阻斷組與對照組上述指標比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表1 各組大鼠肝功能指標及AcSDKP水平

*P<0.05 compared with control group;△P<0.05 compared with blocking group.

表2 各組大鼠肝纖維化指標

*P<0.05 compared with control group;△compared with blocking group.

表3 各組大鼠肝組織中胸腺素β4、POP和ACE蛋白表達水平

*P<0.05 compared with control group;△P<0.05 compared with blocking group.

3 討 論

近年來AcSDKP在臨床上被廣泛關注，既往研究[6]顯示：AcSDKP具有較強抑制巨噬細胞、肥大細胞等炎性細胞浸潤，拮抗成纖維細胞增殖及膠原合成的作用，因而在體內表現出明顯的抗炎及抗纖維化效應。研究[7-8, 14-15]證實：內源性AcSDKP生成主要依靠POP分解胸腺素β4產生，而其降解主要依靠ACE分解，這些AcSDKP生成與降解系統均完整地存在于肝內。生理學研究[9, 16]也證實：AcSDKP在肝內濃度接近于心臟和腎臟。動物實驗[7-12]顯示：大鼠心臟組織ACE活性上調或抑制POP活性，均降低心臟和/或腎臟組織中內源性AcSDKP水平，導致心臟纖維化和/或腎小球硬化。實驗動物持續注射外源性AcSDKP能有效抑制高血壓、心臟缺血再灌注、高血壓腎損害和糖尿病腎損害中出現的靶器官纖維化[10-11, 13-14]。最近研究[12, 15]顯示：AcSDKP能有效介導ACE抑制劑的抗心、腎纖維化效應。與在體研究結果類似，離體研究[13, 16]也顯示：AcSDKP能有效抗心臟成纖細胞和腎小球系膜細胞的纖維化活性。

雖然AcSDKP在肝內的生理作用目前未明確，但是根據以上相關研究背景，可以推測內源性AcSDKP可能參與對肝臟纖維化及細胞外基質自穩定的調控[17-18]。最近研究[1,4]顯示：機體多種器官及組織中廣泛存在胸腺素β4-POP-AcSDKP軸，且發揮重要生物學功能。有研究者在膽總管結扎和四氯化碳注射等大鼠肝纖維化模型中，ACEI(如卡托普利等)已被證實對肝纖維化有保護作用，推測其作用機制可能與上調AcSDKP有關[19-20]。但經典大鼠肝纖維化模型中內源性AcSDKP水平動態變化及調控因子(如胸腺素β4、POP和ACE等)改變情況，目前尚無臨床研究進行闡述，因此本研究通過選擇膽總管結扎大鼠肝纖維化模型來探討此病理生理過程[21-23]。

本研究結果顯示：通過膽總管結扎制備大鼠肝纖維化模型病理生理模擬程度較好，大鼠的肝功能明顯降低，肝纖維化指標明顯升高，病理檢查也支持肝纖維化病理發生，該病理過程在結扎膽總管后第2周顯現，這一結果與既往研究[19-20]結論相似。而模型組大鼠肝組織中AcSDKP水平也是在第2周明顯降低，與肝纖維化保持同步，證實內源性AcSDKP水平減少會誘導肝臟纖維化發生。同時模型組大鼠肝組織中POP水平明顯降低、胸腺素β4水平明顯增加，提示內源性AcSDKP生成降低；而肝組織中ACE水平明顯升高，提示內源性AcSDKP降解增加，導致機體內肝組織內源性AcSDKP水平在第2周明顯降低。本研究通過應用AcSDKP特異性水解酶阻斷劑ACEI來提高動物模型體內的內源性AcSDKP水平，結果顯示：大鼠肝臟纖維化程度明顯改善，這也證實內源性AcSDKP水平降低可能是膽總管結扎致使大鼠發生肝纖維化的重要原因之一。

綜上所述，膽總管結扎大鼠肝纖維化所致內源性AcSDKP水平明顯降低有可能是通過Tβ4-POP-AcSDKP軸實現的，對于Tβ4-POP-AcsDKP軸致使內源性AcsDKP缺乏的具體機制在今后的研究中值得進一步探討。