髓樣分化因子88在結直腸癌患者癌組織中的表達及其臨床意義

朱廣偉，鄭 煒，黃永建，華 進，楊樹鋼，葉建新

(福建醫科大學附屬第一醫院胃腸外科二區 福建醫科大學消化道惡性腫瘤教育部重點實驗室，福建 福州 350005)

髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)是Toll樣受體(Toll like receptors, TLRs)信號通路中的關鍵分子[1-2]。MyD88是Toll樣受體信號通路中重要的接頭蛋白，在TLRs信號通路中處于節點位置和關鍵點，調控信號通路下游因子的活化，從而啟動免疫反應，且與多種疾病的發生有關聯[3-4]。研究[4-6]表明：MyD88不僅在免疫性疾病中具有重要作用，在炎癥性等疾病的發展中也具有重要作用。近年來研究[7-8]顯示：MyD88在多種腫瘤的發生發展和侵襲中發揮重要的作用。但僅有少量報道關于MyD88在結直腸癌組織中的表達[9]。為了進一步探討MyD88與結直腸癌及其預后的關系，本研究通過檢測結直腸癌患者癌組織中MyD88的表達，分析其與患者臨床參數之間的關系，以期為結直腸癌的治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 主要試劑和儀器 DAB顯色試劑盒購于北京中杉金橋公司，即用型UltraSensitive SP試劑盒購于福州邁新生物技術開發有限公司，MyD88抗體購于美國Affinity生物公司。隔水式恒溫烤箱GNP-9080購于上海精宏實驗設備有限公司，組織切片機AS325購于英國Shandon公司，光學顯微鏡DM4000B購于德國Leica公司。

1.2 臨床資料 選擇2010年3月—2011年3月在福建醫科大學附屬第一醫院胃腸外科接受手術治療并經過病理證實的結直腸癌患者90例，年齡28～83歲，平均年齡(61.0±11.6)歲。本組研究對象均在入院時簽署知情同意書，知曉其腫瘤組織標本和臨床病理資料用于科學研究。研究對象每隔3個月經電話或者門診隨訪，本研究經本院倫理委員會批準。

1.3 免疫組織化學染色 取術中切除的新鮮結直腸癌腫瘤組織標本和癌遠旁正常結直腸組織標本(距離腫瘤大于8 cm)，經甲醛固定，行常規石蠟包埋后備用。石蠟標本行4 μm厚度連續切片，將石蠟切片脫蠟、水化，抗原修復暴露抗原決定簇，3%H2O2去離子水孵育25 min，PBS沖洗，去除PBS后，加入鼠抗人MyD88抗體50 μL后，4℃過夜；復溫后去除PBS，加入即用型UltraSensitive S-P試劑盒，PBS沖洗后加新鮮配置的DAB底物液，顯微鏡下觀察4～6 min，掌握染色時間，自來水沖洗。蘇木素復染1～3 min，自來水、雙蒸水洗5 min，PBS返藍5 min，脫水、透明、中性樹膠封片。

免疫組織化學的染色結果評估采用Image-Pro Plus 6.0軟件(美國Media Cybernetics公司)。每組隨機抽出15張切片，每片隨機選擇3個視野，每組共45個視野，使用軟件計算每個視野的平均吸光度(A)值，即積分A值(IA)/陽性面積，半定量MyD88的表達情況。

2 結 果

2.1 MyD88蛋白在結直腸癌患者癌組織和癌遠旁組織中的表達水平 MyD88在結直腸癌患者癌遠旁組織中的表達水平為0.165 4±0.142 6，明顯低于MyD88在結直腸癌組織中的表達水平(0.387 9±0.182 6，P<0.01)。見圖1(插頁五)。

2.2 不同臨床病理參數結直腸癌患者結直腸癌組織中MyD88的表達水平 結直腸癌組織中MyD88的表達水平與結直腸癌患者的年齡、性別、腫瘤大小和組織學分化無關聯(P>0.05)。MyD88在結直腸癌組織中的表達水平：Ⅰ-Ⅱ期患者明顯低于Ⅲ-Ⅳ期患者(P<0.05)，T1-T2期患者明顯低于T3-T4期患者(P<0.05)，M0患者明顯低于M1患者(P<0.05)，無淋巴轉移患者明顯低于有淋巴轉移患者(P<0.05)。見表1。

表1 不同臨床病理參數結直腸癌患者癌組織中MyD88蛋白表達水平

Tab.1 Expression levels of MyD88 in cancer tissue of colorectal cancer patients with different clinicopathological parameters

Clinicopathological parameternMyD88 expression t/FPAge (year) <60 ≥60 33570.254 7±0.069 8 0.295 7±0.102 9 0.1020.867Gender Male Female59310.321 9±0.087 1 0.369 7±0.161 1 0.8060.467Tumor size (cm) ≤3 >338520.354 2±0.124 5 0.372 6±0.098 6 1.0460.330Clinical stage Ⅰ-Ⅱ Ⅲ-Ⅳ21690.216 5±0.139 7 0.357 4±0.162 1 2.5410.003T stage T1-T2 T3-T430600.214 6±0.165 8 0.392 5±0.191 1 2.0750.039M stage M0 M18190.319 4±0.196 5 0.419 6±0.165 72.0730.041Lymph node metastasis No Yes43470.289 7±0.117 5 0.396 4±0.162 3 2.3860.023Histological differentiation Low 230.395 6±0.196 5 Mild 420.368 9±0.202 10.3770.095 High 250.312 0±0.189 5

2.3 MyD88表達水平與結直腸癌患者臨床預后的關系 以90例患者結直腸癌組織MyD88表達水平均數(0.326 5)為準，MyD88高表達組34例，低表達組56例。Kaplan-Meier法生存分析結果顯示：MyD88高表達組結直腸癌患者的生存率明顯低于低表達組(P<0.05)。見圖2。

*P<0.05 compared with low MyD88 group.

Fig.2 Survival curves of patients with colorectal cancer

3 討 論

MyD88基因主要在免疫細胞中表達，包括T細胞、B細胞和單核細胞等。蛋白結構研究顯示：MyD88的分子結構包含C端Toll樣受體和白細胞介素1受體相關結構域(TLR/IL-1R related domain,TIR)和N端結構域，與死亡結構域相似，可與其他具有死亡結構域的蛋白相互作用；另外，MyD88也存在中間結構域，可與IL-1相關受體激酶(interleukin-1 receptor-associated kinase, IRAK)相互作用，介導TLR信號的傳導，激活下游基因的轉錄[10]。在哺乳動物的先天免疫中MyD88發揮重要的作用，是激活先天免疫反應的基本因子[11]。

MyD88發揮功能調控細胞生物學行為調控的重要因子是核因子κB(NF-κB)和活化蛋白1(AP-1)，其是重要的細胞信號轉導因子，調控各種基因的轉錄表達從而發揮生物學功能，如腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素6(IL-6)、白細胞介素12(IL-12)和干擾素β(INF-β)等[12-13]。MyD88通過對多種信號通路的調控，在免疫反應、炎癥反應及腫瘤的發生發展過程中均發揮重要作用[14-15]。

MyD88在結直腸癌組織中的表達及與結直腸癌患者預后的關系，目前研究報道較少。杜永生[16]研究顯示：MyD88 mRNA在結直腸癌組織中的表達水平降低，且與患者的性別、年齡、分化程度、腫瘤直徑、癌胚抗原(CEA)、有無淋巴轉移、浸潤程度、分布部位和Duke’s分期無關。秦艷等[17]研究顯示：MyD88在結直腸癌組織中的表達水平升高，且組織異型性越大，表達水平越高，MyD88在正常黏膜、增生性息肉、腺瘤和腺癌組織中的表達水平逐漸升高。于月紅等[18]研究顯示：結直腸癌組織中MyD88 mRNA表達水平明顯升高，低分化癌組織中MyD88 mRNA表達水平最高，臨床分期越晚MyD88 mRNA表達水平越高。另外，Wang 等[9]發現：MyD88在結直腸癌組織中呈高表達，且肝轉移患者MyD88表達水平更高；MyD88高表達的結直腸癌患者預后差，是結直腸癌患者預后的獨立危險因素。由此可見，到目前為止MyD88在結直腸癌組織中的表達及臨床意義尚無定論，需要進一步的研究。

本研究結果顯示：MyD88在結直腸癌患者癌遠旁組織中的表達水平明顯低于結直腸癌組織，表明MyD88在結直腸癌組織中的表達水平增加。杜永生等[16]發現：結直腸癌組織中MyD88 mRNA表達水平降低，且與患者各臨床病理因素無關。另外，于月紅等[18]報道：結直腸癌患者癌組織中的mRNA表達水平明顯升高，低分化癌組織中MyD88 mRNA表達水平最高，且臨床分期越晚，MyD88 mRNA表達水平越高。這種完全不一致的報道，可能是因為mRNA檢測的誤差，也可能是因為樣本量的問題；另外，mRNA的檢測不能反映MyD88蛋白在結直腸癌組織的表達情況，免疫組織化學檢測蛋白表達水平具有更好的優勢，因為mRNA表達水平高，不一定蛋白的表達水平高。

秦艷等[17]雖然檢測了MyD88在結直腸癌組織中表達的情況，也揭示出從腺瘤到癌組織中MyD88 表達的明顯差異，但是并未分析MyD88在結直腸癌中的表達與患者預后的關系。本研究顯示：MyD88 高表達的結直腸癌患者生存率明顯降低；且臨床病理參數分析顯示：MyD88的表達水平與結直腸癌患者的年齡、性別、腫瘤大小和組織學分化無關，與患者的臨床分期、T分期、M分期和淋巴結轉移狀態有關，提示MyD88高表達水平促進了結直腸癌的進展。

關于MyD88在結直腸癌中的作用，本課題組正在進行下一步研究，如MyD88和腫瘤化療耐藥性的問題。另外，本課題組將進一步研究MyD88在結直腸癌發生發展中發揮的作用，為結直腸癌的臨床治療提供理論依據。