食品抗氧化劑叔丁基對苯二酚與溶菌酶結合特性的熒光光譜學研究

吳 笛， 梅 森， 胡 霞， 包苗苗， 康馨樾， 王 衛

(1.成都大學 肉類加工四川省重點實驗室， 四川 成都 610106； 2.成都大學 藥學與生物工程學院， 四川 成都 610106)

0 引 言

目前，酚類抗氧化劑作為食品添加劑被廣泛用于食品的生產加工過程中，以抵抗因氧化引起的脂肪酸敗、顏色改變等食品腐壞[1].叔丁基對苯二酚(Tert-butylhydroquinone，TBHQ)是一種脂溶性酚類食品抗氧化劑，常被用來保護食品的油脂和脂肪，其能有效地抑制豬油、家禽脂肪的氧化變質[2].但現有的TBHQ作為食品防腐用化學制品的應用條例的相關規定并不嚴格.有研究表明，TBHQ會傷害生物體自身的防御機制，且該酚類食品抗氧化劑在其代謝途徑中還可能存在潛在的致突變、致癌性等情況[3-5].溶菌酶(Lysozyme，LYZ)是一類具有抗菌作用的蛋白酶，它是一個單一的、由129個氨基酸殘基折疊并帶有2個域的非糖基化多肽鏈，且其中含6個色氨酸和3個酪氨酸[6-7].這種蛋白質天然豐度高，作為生物體內的酶具有獨特的可以破壞細菌細胞壁的能力，從而防止細菌感染[8].當多樣的內生和外生有機小分子進入人體，配體與LYZ的結合容易被觀察到[9].因此，本研究將LYZ選作與TBHQ在人體內相互作用的研究對象，在分子水平上探究苯酚類抗氧化劑與抗菌功能性蛋白質間的相互作用機理，以探討有潛在毒性的食品添加劑在人體內可能的傳遞途徑.

1 材料與儀器

1.1 材 料

實驗所用材料包括：TBHQ(批號，209429，純度>99%)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；LYZ(批號，A610308，純度>98%)，上海生工生物工程股份有限公司；無水乙醇(批號，2017092102)，成都市科龍化工試劑廠；磷酸鹽(PBS)緩沖液干粉(批號，P1022)，北京索萊寶科技有限公司；華法林(批號，419960，純度≥98%)、布洛芬(批號，408218，純度≥98%)，購自北京百靈威科技有限公司；三蒸水，實驗室自制.

1.2 儀 器

實驗所用儀器包括：CARY Eclipse型熒光光譜儀(美國VARIAN公司)；Horiba Jobin Yvon FluoroLog-TCSPC型熒光光度計(法國HORIBA科學儀器公司)；pHS-3C型精密pH計(雷磁—上海精科有限公司)；BS-224S型電子天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司)；XW-80A型旋渦混合器(上海青浦滬西儀器廠)；HH-S6型恒溫水浴鍋(鄭州長城科工貿有限公司).

1.3 方 法

1.3.1 樣品制備.

TBHQ溶解在無水乙醇中，儲備液濃度為2.0×10-3mol/L；LYZ儲備液(1.0×10-4mol/L)由0.05 mol/LPBS緩沖溶液配制(含0.1 mol/L氯化鈉調節樣品溶液離子強度).

在預實驗階段，首先對PBS緩沖溶液的pH值的選擇進行了測試，即向處于生理酸堿性條件(pH 7.4)和處于LYZ最適pH條件(pH 6.5)的LYZ溶液中分別加入0×10-6、1.0×10-6、1.5×10-6、2.0×10-6、3.0×10-6、5.0×10-6、1.0×10-5mol/L的TBHQ溶液，發現pH值為6.5時，該狀態更適合LYZ穩定地與有機小分子反應，故本實驗中PBS緩沖液的pH值均為6.5.在實驗中，LYZ的濃度由其溶液在波長280 nm處的摩爾消光系數值37 750 mol-1·cm-1校正確定[10].同時，所有溶液均在使用時稀釋至所需濃度，并在4 ℃條件下避光保存.

1.3.2 熒光滴定.

熒光強度測定時，在2.0×10-6mol/L的LYZ溶液中分別滴加0×10-6、1.0×10-6、2×10-6、4.0×10-6、6.0×10-6、8.0×10-6、1.0×10-5、1.2×10-5mol/L的TBHQ溶液.用PBS緩沖溶液定容，渦旋混勻，分別在25 ℃、31 ℃及37 ℃條件下反應1 h.測定所用石英比色池光程為1.0 cm，激發波長為295 nm，激發狹縫為5 nm，發射狹縫為10 nm，測量范圍為300～500 nm.

同時，所有熒光強度的測量都按照文獻[11]中的相關方法進行內濾效應的校正.

1.3.3 同步熒光.

在與熒光滴定實驗相同條件下，激發波長范圍設置為200～400 nm，激發波長與發射波長的差值(Δλ)分別為15 nm和60 nm，分別對應酪氨酸和色氨酸微環境特征，狹縫寬度設置與熒光強度實驗相同.

1.3.4 三維熒光.

室溫下，掃描TBHQ存在與否時的LYZ的三維熒光譜圖，LYZ的濃度為2.0×10-6mol/L，混合體系樣品由LYZ和TBHQ以摩爾比1∶10組成.測定時，激發波長的變化范圍為200～400 nm，變化間隔為5 nm，發射波長收集范圍為200～500 nm.

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1.3.5 熒光壽命.

熒光壽命的測試在FluoroMax-4模塊式熒光光譜儀完成.室溫下設定，激發波長為280 nm，發射波長為345 nm.測試樣品共計3個樣：在2.0×10-6mol/L的LYZ溶液中分別滴加0×10-6、4.0×10-6、1.2×10-5mol/L的TBHQ溶液.

1.3.6 數據分析.

在熒光滴定實驗中，所有的結果均為3次獨立重復性實驗得到.最大的實驗測量誤差保持在5%以內.數據在經過方差分析后由OriginPro軟件處理，其中，熒光壽命的數據處理采用迭代擬合方法，并以χ2值及殘差值進行評估.

2 結果與分析

2.1 TBHQ和LYZ相互作用機理分析

2.1.1 熒光猝滅分析.

熒光測量能夠提供小分子物質對蛋白質的結合信息[12].LYZ是一個具有多色氨酸(Tryptophan，Trp)殘基的蛋白質，其單晶結構顯示，每一個LYZ分子有6個色氨酸.色氨酸具有顯著的熒光強度和對周圍微環境敏感的特性，可作為LYZ內源性熒光探針.當LYZ和其他化合物作用時，它的內源性熒光(主要由編號為Trp62，Trp63和Trp108的氨基酸貢獻)會隨配體的濃度改變而變化，從而提供配體導致LYZ熒光現象變化的信息[13].在配體小分子和LYZ發生作用時，LYZ分子可能發生構象轉變，與基質相結合、離解或變性等情況，這將導致其本身的熒光強度降低而發生熒光猝滅.測試溫度為25 ℃時，1～7號樣品中，LYZ濃度保持恒定，TBHQ濃度等梯度增加，TBHQ對LYZ的熒光猝滅圖譜如圖1所示.

圖1 TBHQ對LYZ的熒光猝滅圖譜(25 ℃)

由圖1可見，體系中加入TBHQ后，LYZ內源熒光強度明顯降低，且隨著TBHQ濃度增加，猝滅效果增強.結果表明，當LYZ與TBHQ共存于一個體系中時，兩者之間會發生某種作用，從而導致LYZ內源熒光強度的降低，而該熒光猝滅機制與溫度密切相關.對此，本實驗采用Stern-Volmer方程[14]來分析不同溫度下(25 ℃、31 ℃及37 ℃)的熒光猝滅類型.

(1)

式中F0和F分別為加入TBHQ前后LYZ的熒光強度；[Q]為TBHQ濃度；KSV由F0/F對[Q]線性回歸作圖得到，為Stern-Volmer方程的猝滅常數.

由恒溫梯度所得數據，經Stern-Volmer方程擬合，得到3個溫度下猝滅常數KSV分別為，1.982×104L/mol(25 ℃，R2=0.9877)、1.925×104L/mol(31 ℃，R2=0.9900)和1.894×104L/mol(37 ℃，R2=0.9880).擬合數據顯示，猝滅常數隨溫度升高而略減小，根據熒光猝滅理論[12]，TBHQ可能與LYZ結合形成了體系復合物，發生了靜態猝滅.

2.1.2 熒光壽命分析.

由“2.1.1”項中Stern-Volmer方程擬合結果可知，隨著溫度的增加，猝滅常數KSV逐漸減小，但這種趨勢并不太明顯.為進一步闡明該體系的熒光猝滅機理，本研究檢測得到了熒光體的熒光壽命τ值的變化，結果如圖2所示.

圖2不同濃度TBHQ對應的LYZ的熒光衰減曲線

由于基態復合物的形成不會改變未結合熒光體的熒光衰減時間，因此，熒光體的熒光壽命會保持不變.猝滅劑與熒光體在飽和情況下，檢測的是復合體的熒光壽命，此時相對于空白熒光體的熒光壽命，復合體可能出現輕微壽命減弱的情況.動態猝滅是作用在整個激發態的過程，這會導致整個熒光體激發態的衰減加快，熒光體熒光壽命減小.該體系熒光壽命通常用平均熒光壽命[15]表示，

τ=τ1α1+τ2α2+τ3α3

(2)

式中，τ為平均熒光壽命；τi和αi分別是i次擬合對應的延遲時間和相對強度.

計算得到LYZ-TBHQ體系不同濃度下的熒光壽命如表1所示.

表1 不同TBHQ濃度對應的LYZ熒光壽命

表1數據顯示，隨著體系中TBHQ濃度的增加，LYZ熒光壽命出現輕微降低，降幅小于1%.據此可以判定，TBHQ對LYZ內源熒光的猝滅遵循靜態猝滅機理，TBHQ通過與LYZ結合形成了復合物.

2.2 TBHQ對LYZ的結合特性分析

2.2.1 結合強度.

當TBHQ對LYZ的猝滅過程為靜態猝滅時，假定小分子配體TBHQ在LYZ上有n個相同且獨立的結合位點，那么熒光強度、猝滅劑的濃度與結合常數及結合位點數之間的關系符合雙對數方程，即修正的Stern-Volmer方程，也稱為雙對數曲線[12]，

log(F0-F)/F=logKa+nlog[Q]

(3)

式中，Ka(截距)為TBHQ與LYZ的結合常數；n(斜率)表示結合位點數.

不同溫度下，TBHQ與LYZ相互作用的計算結果如表2所示.

表2 不同溫度下TBHQ和LYZ相互作用體系中的結合常數、結合位點數及熱力學參數

表2數據表明，TBHQ能與LYZ形成較強的結合，結合常數隨溫度的升高而降低.TBHQ與LYZ的結合位點數大約為1，隨測試溫度的改變，結合位點數無明顯變化.

2.2.2 熱力學參數和結合力類型的確定.

通常情況下，有機小分子與蛋白質間的相互作用力可能包括靜電作用力、氫鍵作用、范德華力和疏水作用，具體可由熱力學參數如焓變、吉布斯自由能變化和熵變的正負性和大小進行判斷.由Van't Hoff方程和Gibbs-Helmholtz 方程，可根據不同溫度下結合常數的變化計算得到TBHQ與LYZ的相互作用熱力學參數為，

(4)

ΔG=ΔH-TΔS

(5)

式中，T為實驗溫度，Ka為相應溫度下的結合常數，R為摩爾氣體常數，ΔH為相互作用體系焓變，ΔS為體系熵變，ΔG為體系的吉布斯函數.

有研究認為，當ΔH<0或ΔH≈0而ΔS>0時，主要作用力為靜電作用力；當ΔH<0且ΔS<0時，主要作用力為范德華力或氫鍵作用；當ΔH>0且ΔS>0時，主要作用力為疏水性作用[16].表2數據顯示，ΔG為負值，表明TBHQ和LYZ的結合是一個自發的過程，且ΔH和ΔS在此溫度范圍內保持負值，說明TBHQ與LYZ的主要相互作用力為氫鍵作用和范德華力.

2.3 TBHQ對LYZ構象及氨基酸殘基微環境的影響

利用同步熒光法的優勢在于該法可以將普通熒光光譜內源性熒光生色團的重疊發射峰區分開來.Δλ=15 nm 時，表現Tyr的特征同步熒光峰；Δλ=60 nm時，則會表現Trp的特征同步熒光峰[16].為了闡明LYZ-TBHQ體系中，熒光生色團中的酪氨酸和色氨酸殘基到底發生了怎樣的變化，本研究進行了同步熒光實驗，Δλ固定在15 nm和60 nm時對應的同步熒光譜圖如圖3所示.

圖3 TBHQ-LYZ體系同步熒光光譜及三維熒光曲面等高線圖

圖3顯示，隨著TBHQ的濃度增加，LYZ熒光強度降低，說明TBHQ同時猝滅了色氨酸與酪氨酸殘基發射的熒光.Δλ固定為60 nm時,可以看到熒光強度降低且伴隨著峰位藍移，暗示著色氨酸殘基所處微環境極性減小或疏水性增加.而Δλ固定為15 nm時，峰位未發生明顯移動.同步熒光結果證明TBHQ在LYZ上的結合位置應當更靠近色氨酸殘基.

而在LYZ的三維熒光曲面圖中，激發波長225 nm處(左)波形由色氨酸和酪氨酸殘基發射熒光引起，約280 nm處(右)的峰則為為多肽骨架出峰[17].圖3(C)、(D)分別為LYZ和LYZ-TBHQ體系的三維熒光.據該譜圖顯示，因TBHQ的加入，色氨酸與酪氨酸殘基峰的強度明顯降低，而多肽骨架峰則出現了輕微的增強.表明該體系中，TBHQ與LYZ的結合對LYZ中色氨酸和酪氨酸殘基影響相對較顯著，而對LYZ多肽骨架僅顯示了輕微的干擾，LYZ的整體構象仍保持完整.

3 結 論

本研究表明，熒光光譜法是探討食品抗氧化劑TBHQ與LYZ結合特性的一種有效方法.研究結果顯示，酚類食品抗氧化劑TBHQ能與LYZ形成不發光的基態復合物，結合常數數量級處于在104的中等級別，氫鍵作用和范德華力主導這一自發結合過程，且該結合過程會導致LYZ的氨基酸殘基微環境發生改變，且LYZ的整體構象仍保持完整，但其具體結合位置尚需進一步研究.本研究結果有助于在分子水平上理解酚類食品抗氧化劑進入生物體后，LYZ對其的攜帶和轉運過程.