食源性金黃色葡萄球菌的耐藥機制及檢測方法研究進展

韋志萍　解艷秋

【摘要】 金黃色葡萄球菌（SA）可產生多種毒素及多種酶類，易引起人和動物化膿感染、人食物中毒。SA可在食品加工、包裝及運輸過程污染食品。其耐藥機制主要為不合理的使用抗生素和消毒劑。目前，SA對大環內酯類、β-內酰胺類、氟喹諾酮類、環脂肽、糖肽類、唑烷酮類藥物及消毒劑均有耐藥性，對食源性SA的檢測除了傳統的“金標準”檢測方法外，還有多種基于分子生物學和免疫學的現代檢測技術，這些檢測技術對食源性SA檢測各有優缺點，需多種技術結合以提高其整體檢測效果。

【關鍵詞】 食源性金黃色葡萄球菌； 耐藥； 檢測方法

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2018.23.086 文獻標識碼 A 文章編號 1674-6805（2018）23-0-03

金黃色葡萄球菌（SA）是常見的化膿性感染致病菌，它可產生多種毒素及多種酶類，易引起人和動物化膿感染、人食物中毒[1]。SA可在食品加工、包裝及運輸過程污染食品，其分泌的毒素對熱不敏感，即便加熱煮沸30 min仍可致病[2]。近年來，隨著抗生素大量使用，SA感染率的升高，耐藥率也隨之升高，并出現多重耐藥性。目前，在醫院、社區環境中均存在耐藥性強、毒力強的耐藥型SA，這給金黃色葡萄球菌感染的防治增加了難度。本文就近年來SA的耐藥機制及檢測方法進展做一綜述。

1 耐藥機制

不合理的使用抗生素、消毒劑是SA耐藥菌株增加、多重耐藥菌出現的主要原因。

1.1 大環內酯類

SA質粒和染色體含有erm基因，這些基因是SA對大環內酯類藥產生耐藥性的主要原因[3]。erm基因主要有ermA、B、C基因。大環內酯類藥的抗菌作用是通過抑制細菌內的核糖體23S rRNA基因活性，阻斷蛋白質合成來實現的[4]。其耐藥性是因甲基轉移酶erm基因催化該基因甲基化，致使藥物與RNA親和力降低而產生[5]。另外，核糖體大亞基23S rRNA堿基、核糖體蛋白L4的突變均可導致大環內酯類藥的耐藥性[6]。

1.2 β-內酰胺類

SA耐藥性的產生是由于其存在一個mecA這一特有的耐藥基因，該基因在SA對β-內酰胺類藥物耐藥方面起著重要作用。SA菌體表面存在一種青霉素結合蛋白，其在細菌生長繁殖中發揮重要作用。因青霉素結合蛋白易與β-內酰胺類抗菌藥結合而失去活性，導致細胞壁合成受阻而使細胞凋亡[7]。mecA上有一可移動染色體盒SCCmec中，可編碼出新的青霉素結合蛋白。這一新的青霉素結合蛋白與β-內酰胺類藥親和力降低，但它同樣可參與細胞壁的合成，故可替代失活的青霉素結合蛋白參與細胞壁的合成，從而產生耐藥性[8]。

1.3 氟喹諾酮類

氟喹諾酮類藥物對SA的作用靶位酶改變及其在菌體內蓄積量減少是引起耐藥性的重要原因。此類藥物基本結構為1，4-二氫-4-氧代-3-喹啉羧酸，其可抑制細菌的DNA拓撲異構酶、促旋酶的活性，阻斷其遺傳物質的轉錄而使其凋亡。研究證實，除了靶酶基因位點突變引起靶酶空間位點變異外，細菌對藥物排泄增加、攝入減少引起體內藥物蓄積減少也可導致細菌對氟喹諾酮類藥物產生耐藥性，其中以排泄增加為主，與排泄相關的基因主要有nor基因[9-10]。

1.4 環脂肽

細胞膜結構和功能改變、基因突變和細胞壁異常改變均是SA對環脂肽耐藥的原因。環脂肽殺菌作用是通過影響細胞膜對氨基酸的轉運，阻斷細胞壁肽聚糖磷壁酸酯質的合成，動作細胞膜去極化來實現[11]。SA對環脂肽的耐藥機制為：其一，抗菌作用靶點基因突變，引起藥物與細菌結合點減少，造成藥物對SA的殺死能力減低而產生耐藥性；其二，參與細胞壁合成的相關基因表達升高，造成細菌細胞壁增厚，使藥物殺死細菌能力降低而產生耐藥性[12]。

1.5 糖肽類

SA對糖肽類藥物的耐藥性主要與細胞壁增厚、抗生素誘導、青霉素結合蛋白改變、調節基因改變、耐藥基因轉移、肽聚糖交聯減少等。SA細胞的細胞壁中的肽聚糖層存在D-丙氨酰-D-丙氨酰酸殘基，其一旦被萬古霉素結合，則使大多數藥物不能通過細胞壁進入細胞內，從而使藥物殺死細胞的能力減弱而產生耐藥性[11]；一些糖肽類藥物作用于細胞壁會引起青霉素結合蛋白表達增加，細胞壁增厚，使藥物進入細菌細胞內的濃度降低，從而降低了對細胞的殺傷力[13]；調節基因改變，如agr基因功能缺失等也會導致SA對糖肽類藥物耐藥；桂中玉等[14]報道，SA耐藥菌株中的耐藥基因可從腸球菌質粒轉移而來，故耐藥基因轉移可引起細菌耐藥，肽聚糖單體五肽上的酰胺化谷氨酸殘基數量減少引起肽聚糖交聯減少，肽聚糖單體增加，使更多的萬古霉素被結合，造成藥物與細菌靶位接觸減少；體外實驗研究發現，萬古霉素耐藥菌株在無萬古霉素的情況下，其耐藥性降低，說明抗生素誘導也可引起細菌耐藥性增加[15]。

1.6 消毒劑

外排泵分子、質粒介導的耐藥基因qac是SA對消毒劑耐藥的重要因素。消毒劑是通過物理和化學途徑作用于細胞外部、細胞質等靶點，破壞細胞壁和細胞膜，造成胞內物質外滲、氧化胞內酶等方式而產生殺菌作用，這種作用無選擇性。外排泵分子的介導的耐藥機制為，消毒劑可致細菌染色體上的norA、norC基因表達上調，增強了SA對消毒劑的抵抗能力[16]。QacR蛋白是qacA基因的負調控因子，當其作用底物存在時，消毒劑可結合QacR蛋白，從而阻止了消毒劑與qacA基因結合，造成qacA表達上調，促進了細胞消除其內的消毒劑[17]。

1.7 唑烷酮類

SA對唑烷酮類藥物的耐藥機制與存在cfr基因、23S rRNA V 區突變有關[18]。利奈唑胺是常用的唑烷酮類藥物之一，它的殺菌作用是通過結合細菌中核糖體肽酰轉移酶活性中心，抑制蛋白質的合成來實現[16]。細菌中的核糖體肽酰轉移酶活性中心主要由rRNA組成，故其上的RNA突變是SA對利奈唑胺耐藥的一個重要因素；另外，23S rRNA V 區上的G2503位點是cfr基因的作用靶點，故存在cfr 基因同樣可引起細菌耐藥[17]。

2 檢測方法

目前，對SA的檢測主要包括兩個方面：耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的檢測及其產生毒素的檢測。傳統的“金標準”檢測方法是經增菌培養、選擇性培養后進行鑒定試驗，如甘露醇發酵試驗、血漿凝固酶試驗等，該方法操作簡便，費用低，但存在檢測時間長、假陰性高、敏感度低等不足。近期，陸續出現一些有關快速、敏感性高的檢測SA的方法的報道，主要有分子生物學和免疫學方法（抗原抗體反應）兩類，以下對這兩類檢測方法進行具體闡述。

2.1 分子生物學方法

與免疫學方法相比，分子生物學檢測方法對SA新產生的毒素、特異性基因具有明顯優勢，常見的檢測方法有聚合酶鏈反應（PCR）技術、環介導等溫擴增（LAMP）技術、基因芯片。

2.1.1 PCR技術 其通過變性、退火和延伸的基本步驟進行基因體外擴增。mecA基因存在一種活性很低的青霉素結合蛋白，它可與β-內酰胺類藥物結合而產生耐藥性。SA菌屬特異性鑒別基因16S rRNA、23S rRNA、耐熱核酸酶基因等可作為檢測靶點而用于SA的檢測[18]。當傳統方法檢測SA陰性時，可用PCR檢測細菌內毒素以判斷是否存在SA感染[19]。

2.1.1.1 多重PCR 普通的PCR只有一對引物，PCR擴增出一個核酸片段，多重PCR則用≥2對引物同時擴增多個核酸片段，既可檢測同菌種的不同靶基因，還可同時檢測不同菌種，其效率顯著高于普通PCR[20]。

2.1.1.2 Real-time熒光定量PCR 其原理是通過檢測熒光強度的即時變化以檢出樣品基因拷貝數，進行無復雜擴增產物后處理過程，該法極大提高了基因檢測的特異性，且耗時短、效率高，故被廣泛應用[21]。為了進一步提高檢出效率，一般需聯合多重PCR檢出法。有學者用Real-time熒光定量PCR及多重PCR對mecA及nuc基因進行檢測，在2 h內即準確檢出SA及耐甲氧西林金黃色葡萄球菌[22]。

PCR技術雖然具有高特異性、高敏感性的優點，但檢測前需增菌，需要較長的時間，目標DNA提取易被各種因素影響；且高擴增能力和高敏感度常引起檢測結果的假陽性，使其臨床應用受到影響。

2.1.2 LAMP LAMP是以可識別靶序列上6個位點的4條引物，用有鏈置換功能的DNA聚合酶，擴增產生莖環結構，對目標DNA大量擴增產生多種片段DNA產物。LAMP具有高特異性的優點，且檢測速度快，效率高。

2.1.3 基因芯片 是在支持物（硅片、玻片等）上固定大量針分子，可同時檢測和分析樣品中的大量序列。其最大特點是可同時檢測大量樣品，且可用熒光檢測大量不同的目標基因。傳統的病原菌檢測手段多僅用于一種或兩種相似的細菌或毒素檢測，然而臨床上或疾病防治中，患者多伴有多種病原菌感染，這給檢測工作增加了難度。

2.2 免疫學方法

2.2.1 免疫磁珠技術 該技術是通過用高度均一的納米磁珠為固相載體，使抗體或抗原偶聯至磁珠上，它是一種免疫捕捉技術，可避免樣品中基質的干擾，還可高效敏感檢出目標物質。

2.2.2 免疫生物傳感器 即集成了生物材料、仿生材料及物理化學換能器并可進行數據分析的一類儀器。換能器類型有光學、電化學、熱學、壓電等。其原理是利用抗原-抗體間的特異性結合，并把這種反應通過物理化學換能器轉化為信息進行傳輸。

2.2.2.1 壓電晶體型生物傳感器 是通過測定抗原-抗體特異性反應前后壓電質量變化而進行信息轉化的一種傳感器。相對于ELISA，其具有操作簡單、耗時少等優勢，但也存在檢測敏感度低的不足。

2.2.2.2 表面等離子體共振生物傳感器 通過測量抗原-抗體特異性結合前后表面等離子體波的共振吸收峰發生的改變以達到檢測目的。與傳統檢測方法比較，表面等離子體共振生物傳感器檢測費用較高，其敏感度和穩定性尚需提高。

2.2.2.3 免疫熒光生物傳感器 對待測物染色使其釋放熒光，或用熒光標記物的抗體與待測物結合后，通過檢測其發出的熒光以達到檢測目的。由于光纖的光學性能好，傳輸損耗低，不易受電磁干擾，已有研究者將其用于SA腸毒素B的檢測。雖對SA檢測的抗原-抗體檢測體系無須提取DNA，但由于抗體的成分為蛋白質，因此存在合成困難、不穩定、成本高、分解率高等不足，使其應用范圍受到了限制。

食源性SA的感染越來越普遍，主要是由于抗生素的大量使用引起的耐藥，不合理的使用抗生素、消毒劑是其耐藥主要原因。對食源性SA的檢測除了傳統的“金標準”檢測方法外，還有多種基于分子生物學和免疫學的現代檢測技術，這些檢測技術對食源性SA檢測各有優缺點，需多種技術結合以提高其整體檢測效果。

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（收稿日期：2018-03-21）