骨化三醇、雷帕霉素及其聯合使用對人子宮內膜癌Ishikawa細胞株的作用及機制研究

張錚錚，劉 筱，徐 浩，魏 敏，杜文升，陸曉媛

(徐州醫科大學 1. 附屬醫院婦產科、2. 婦產科教研室、3. 附屬醫院急救中心，江蘇 徐州 221002)

目前，子宮內膜癌多采用手術與化療相結合的綜合治療方法。然而，化療藥物多存在毒性大、副作用強的缺點，且長期使用易產生耐藥性[1-2]。因此，進一步尋找新的高效、低毒化療藥物仍是一個非常有意義的臨床熱點問題[3]。

骨化三醇(calcitriol)又稱1，25-(OH)2D3，是維生素D3的重要活性代謝產物之一。通過激活特異維生素D受體(vitamin D receptor，VDR)而發揮其生物學效應[4]。有研究報道，骨化三醇與VDR結合，引起其構象變化和磷酸化，同時可激活PI3K/Akt/mTOR信號通路[5]。而該通路作為細胞內非常重要的信號轉導途徑，在細胞的生長、存活、增殖、凋亡、血管生成、自噬等過程中發揮著極其重要的作用。該通路的紊亂可導致腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡、化療耐藥等[6]。雷帕霉素(rapamycin)及其衍生物是mTOR信號特異性的抑制劑。Grabiner等[7]證實，抑制mTOR通路可以有效阻斷各種生長因子異常信號的轉導，從而抑制癌細胞的發生與生長。但骨化三醇、 雷帕霉素及其二者聯合使用對子宮內膜癌的作用尚未見報道。本研究擬通過觀察骨化三醇、雷帕霉素及其聯合使用對人子宮內膜癌Ishikawa細胞株形態、增殖周期及PI3K/Akt/mTOR信號表達的影響，以期明確其抑癌效應及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株與試劑 子宮內膜癌Ishikawa細胞株，購自南京凱基生物科技發展有限公司。骨化三醇、雷帕霉素均購自美國Sigma公司；細胞周期檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發展有限公司；Akt、mTOR引物由上海英濰捷基貿易有限公司合成；抗mTOR(SC-8319)、Akt(SC-24500)抗體，均購自Santa Cruz Biotechnology；羊抗兔IgG(H+L)、DylightTM680偶聯的二抗，購自美國Thermo Scientific公司；驢抗羊IgG(H+L)(IRDye800CW)，購自美國Abcam公司。

1.1.2儀器 二氧化碳孵育箱(美國Thermo公司)；WFH-204B型手提式紫外分析儀(上海精科實業有限公司)；倒置相差顯微鏡及顯微照相系統(Motic AE 31);Centrifuge 5810R冷凍超速離心機、Mastercycler Gradient PCR反應儀(德國Eppendorf公司)；流式細胞儀(美國ESPELITE公司)；GDS-800數碼凝膠攝影系統(英國UVP公司)。

1.2方法

1.2.1骨化三醇和雷帕霉素抑癌適宜濃度和時間點的篩選 骨化三醇(10-6、10-7、10-8、10-9mol·L-1)及雷帕霉素(100.0、50.0、25.0、12.5 nmol·L-1)分別與人子宮內膜癌Ishikawa細胞株共培養24、48、72 h，同時設立不加藥物的溶媒對照。MTT法測定不同濃度骨化三醇對人子宮內膜癌Ishikawa細胞株增殖的抑制率，抑制率=(1-用藥組OD值/對照組OD值)×100%。以抑制率最高所需較低濃度、較短時間作為適宜濃度和時間點。將抑制率最高且濃度較低的骨化三醇和雷帕霉素混合液作為聯合抑癌的適宜濃度，與人子宮內膜癌Ishikawa細胞株共培養24、48、72 h，藥物合用效果用金氏公式p2推測[8]：q=E(AB)/[EA+(1-EA)×EB]，其中E(AB)為兩藥合用的抑制率，EA和EB為各藥單用時的抑制率。q=0.85～1.15表示兩藥作用相加；q>1.5表示兩藥作用協同；q<0.85表示兩藥作用拮抗，進一步篩選出適宜時間。

1.2.2細胞形態學觀察 用倒置顯微鏡觀測骨化三醇、雷帕霉素及其聯合使用對人子宮內膜癌Ishikawa細胞株形態學的影響。

1.2.3流式細胞術檢測細胞周期 實驗分為骨化三醇組(10-7mol·L-1)、雷帕霉素組(50 nmol·L-1)、聯合組(骨化三醇10-7mol·L-1+雷帕霉素50 nmol·L-1)、溶媒對照組。收集不同藥物作用48 h后的細胞及細胞培養液，按照細胞周期試劑盒說明，2 000 r·min-1離心5 min，棄上清，用PBS輕輕重懸細胞并計數。細胞濃度1×109·L-1，取1 mL單細胞懸液離心后，4℃保存，染色前用PBS洗去固定液；加入100 μL RNase A 37℃水浴30 min；再加入400 μL PI染色混勻，4℃避光30 min；上機檢測，記錄激發波長488 nm處紅色熒光。用流式細胞儀檢測各組對Ishikawa細胞增殖周期的影響。

1.2.4RT-PCR檢測mRNA的表達 參考試劑盒說明，提取Ishikawa細胞的總RNA，逆轉錄成cDNA，并進行cDNA擴增。擴增樣本體系為25 μL。擴增條件均為：94℃預變性30 min；94℃變性30 s，53℃退火30 s，35個循環；72℃ 1 min，72℃ 5 min終止。以β-actin為內參，計算Akt、mTOR mRNA的相對表達量。Akt上游引物：5′-ACGGGCACATTAAGATCACAG-3′，下游引物：5′-GGCTGAGCTTCTTCTCGTACA-3′；mTOR上游引物：5′-CTGGGACTCAAATGTGTGCAGTTC-3′，下游引物5′-GAACAATAGGGTGAATGATCCGGG-3′；內參基因β-actin 上游引物：5′-TCACCCACACTGTGCCCATCTACG-3′，下游引物：5′-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG -3′。

1.2.5Western blot檢測蛋白的表達 將實驗各組細胞按前述方式分組培養，實驗結束后，提取細胞總蛋白。采用BCA法測定蛋白濃度。取適量蛋白樣品加樣，SDS-PAGE電泳，將蛋白條帶轉到PVDF膜上，250 mA電流轉膜30 min，5%脫脂牛奶封閉3 h，4℃孵育一抗過夜，回收、漂洗一抗，然后室溫下孵育二抗2 h，洗滌后加入顯色液，分析各組Akt、mTOR蛋白表達情況。

2 結果

2.1骨化三醇、雷帕霉素以及聯合應用對人子宮內膜癌Ishikawa細胞增殖的影響

2.1.1骨化三醇對Ishikawa細胞增殖的影響 Fig 1A的MTT實驗結果表明，相同濃度的骨化三醇，隨作用時間增加而抑制率上升，似具有時間依賴性。在0～48 h時間范圍內，抑制率曲線的斜率較大，表明其抑制子宮內膜癌細胞增殖作用明顯，而隨著作用時間的延長，在48～72 h時間范圍內，該曲線的斜率明顯減小，曲度趨向平坦，表明其抑制子宮內膜癌細胞增殖作用變化不大。10-7mol·L-1的骨化三醇作用于Ishikawa細胞株48 h的抑制率為(51.82±2.03)%，72 h抑制率為(52.35±3.22)%，均高于其他實驗濃度組。而10-7mol·L-1骨化三醇在48 h和72 h的抑制率差異無統計學意義。結果表明，骨化三醇作用于Ishikawa細胞的最佳濃度為10-7mol·L-1。作用時間方面，雖然72 h的抑制率高于48 h，但兩者差異無統計學意義，從藥物毒性時間依賴性的角度，本實驗選用48 h為最佳作用時間點。

2.1.2雷帕霉素對Ishikawa細胞增殖的影響 Fig 1B實驗結果表明，相同濃度的雷帕霉素，隨作用時間增加而抑制率上升，似具有時間依賴性。在0～48 h時間范圍內，抑制率曲線的斜率較大，表明其抑制子宮內膜癌細胞增殖作用明顯，而隨著作用時間的延長，在48～72 h時間范圍內，該曲線的斜率明顯減小，曲度趨向平坦，表明其抑制子宮內膜癌細胞增殖作用變化不大。100.0 nmol·L-1的雷帕霉素作用于Ishikawa細胞株48 h的抑制率為(46.22±2.62)%，72 h抑制率為(47.26±3.63)%，均高于其他實驗濃度組。但與50.0 nmol·L-1雷帕霉素組相比，在48 h和72 h時間點抑制率差異無統計學意義。結果表明，雷帕霉素作用于Ishikawa細胞的最佳濃度為50.0 nmol·L-1，最佳作用時間點為48 h。

2.1.3骨化三醇聯合雷帕霉素對Ishikawa細胞增殖的影響 根據上述實驗結果，將溶媒對照組、10-7mol·L-1骨化三醇組、50 nmol·L-1雷帕霉素組、聯合用藥組(10-7mol·L-1骨化三醇+50 nmol·L-1雷帕霉素)分別與Ishikawa細胞株共培養48 h。Fig 1C結果表明，骨化三醇聯合雷帕霉素對Ishikawa細胞抑制率為(63.64±2.05)%，均高于其他各組，差異有統計學意義。用金氏公式評價骨化三醇聯合雷帕霉素的應用效果，q值為1.53，表明骨化三醇、雷帕霉素聯合用藥療效優于單獨用藥，為增強效應。

Fig 1 Effect of calcitriol, rapamycin and combination treatment on proliferation of human endometrial carcinoma Ishikawa cells in vitro n=6)

A: The inhibitory rate of calcitriol on Ishikawa cells; B: The inhibitory rate of rapamycin on Ishikawa cells.*P<0.05vs24 h; C: The inhibitory rate of calcitriol and rapamycin on Ishikawa cells.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vscalcitriol and rapamycin combined group.

2.2骨化三醇、雷帕霉素及其聯合使用對Ishikawa細胞形態學的影響將骨化三醇(10-7mol·L-1)、雷帕霉素(50 nmol·L-1)以及骨化三醇聯合雷帕霉素分別與Ishikawa細胞培養48 h。如Fig 2所示，溶媒對照組細胞生長狀態良好，光鏡視野內貼壁細胞密集，胞體飽滿，細胞貼壁生長，透明，表面光滑，折光性好，細胞增殖旺盛。骨化三醇組和雷帕霉素組細胞則出現視野內細胞密度減低，細胞間隙增大，細胞變圓、縮小、邊界清晰，核內顆粒增多，折光性差，邊緣不整，部分懸浮于培養液中；而骨化三醇聯合雷帕霉素組細胞密度進一步減小，部分細胞已解體，見較多的凋亡和壞死細胞懸浮于培養液中。

Fig 2 Number of survival cells under an inverted phase microscope cultured for 48 h(scale bar=100 μm)

A:Control; B：Calcitriol; C：Rapamycin; D：Combination.

2.3骨化三醇、雷帕霉素及其聯合使用對Ishikawa細胞周期的影響如Fig 3所示，與溶媒對照組相比，骨化三醇組、雷帕霉素組在G1峰前均出現較低二倍體細胞凋亡峰，聯合用藥組則在G1峰前出現較高二倍體細胞凋亡峰。Tab 1結果表明，骨化三醇組和雷帕霉素組G0/G1期細胞所占比例均高于溶媒對照組，而S期和G2/M期細胞所占的比例最低；骨化三醇聯合雷帕霉素組的凋亡率高于其各自單獨用藥組(P<0.05)；溶媒對照組細胞大多處于G0/G1期，S期次之，G2/M期最少。骨化三醇或雷帕霉素能使細胞周期發生變化，G0/G1期細胞增加，S期、G2/M期比例稍減少，而聯合用藥G0/G1期細胞增加更明顯，S期、G2/M期細胞比例相應減少，凋亡率明顯增加。

Fig 3 Cell cycle of human endometrial carcinoma Ishikawa cells performed by flow cytometry

A:Control; B：Calcitriol; C：Rapamycin; D：Combination.

Tab 1 Apoptotic rate and percentage of cells during each stage to total cell n=6)

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vscombination

2.4骨化三醇、雷帕霉素及其聯合使用對Ishikawa細胞Akt、mTORmRNA表達的影響Fig 4的RT-PCR結果表明，與對照組相比，骨化三醇組、雷帕霉素組及骨化三醇聯合雷帕霉素組Ishikawa細胞內Akt、mTOR mRNA的表達水平均降低，差異有統計學意義(P<0.05)。其中，骨化三醇聯合雷帕霉素組表達水平最低，與其他組相比差異有統計學意義(P<0.05)。

2.5骨化三醇、雷帕霉素及其聯合使用對Ishikawa細胞Akt、mTOR蛋白表達的影響Fig 5的Western blot結果表明，與對照組相比，骨化三醇組、雷帕霉素組及骨化三醇聯合雷帕霉素組Ishikawa細胞Akt、mTOR蛋白的表達量均降低，差異有統計學意義(P<0.05)。其中，骨化三醇聯合雷帕霉素組表達量最低，與其他組相比差異有統計學意義(P<0.05)。

Fig 4 Expression of Akt and mTOR mRNA in Ishikawa cells cultured for 48 h n=6)

1：Control;2:Calcitriol; 3：Rapamycin; 4：Calcitriol+Rapamycin.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vscombination group

Fig 5 Expression of Akt and mTOR proteins in Ishikawa cells

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vscombination group

3 討論

適宜的藥物濃度和作用時間對藥物的生物學效應至關重要。本實驗采用10-6～10-9mol·L-1的骨化三醇和12.5～100.0 nmol·L-1的雷帕霉素分別與Ishikawa細胞共培養24～72 h，MTT法觀察比較兩種藥物對癌細胞的抑制率，以期尋找適宜的藥物濃度和作用時間。盡管結果表明兩種藥物對癌細胞的抑制率均具有濃度和時間依賴性，但并非呈直線關系。根據抑癌效果曲線圖，可見至一定濃度和時間點，曲線由直線趨轉平緩。鑒于既往資料報道，藥物濃度越高伴隨而來的副作用風險愈大；藥物作用時間越長，常致細胞營養需求量增加、代謝產物增加，細胞生長空間受限，造成缺氧、凋亡等負效應等理由[10]，我們選擇抑制效果相近，而濃度更小的10-7mol·L-1骨化三醇和50.0 nmol·L-1雷帕霉素作為適宜濃度。以48 h作為藥物作用的適宜時間。

我們進一步以上述適宜濃度和時間比較骨化三醇、雷帕霉素以及二者聯合用藥的抑癌效果。單獨和聯合使用骨化三醇與雷帕霉素，均有不同程度的抑制子宮內膜癌細胞作用，但聯合用藥的抑制效率更高。根據藥物合用效果金氏公式測算，q=1.53，表明骨化三醇與雷帕霉素聯合使用，對人子宮內膜癌Ishikawa細胞抑制作用的合用效果為協同作用。

聯合用藥對子宮內膜癌細胞的協同效應在進一步的形態學研究中同樣得到證實。倒置顯微鏡觀察顯示，單獨使用骨化三醇和雷帕霉素，細胞密度較對照組降低，細胞間隙增大，細胞變圓、縮小，核內顆粒增多，凋亡細胞增多，折光性差，邊緣不整，部分懸浮于培養液中；而聯合應藥后可見細胞數量進一步減少，部分細胞已解體，見較多的凋亡和壞死細胞。

細胞增殖是一個連續而又受調節的過程，增殖周期可分為G0/G1期、S期、G2期和M期。檢測上述幾個時間點的增殖狀態可反映骨化三醇、雷帕霉素及其聯合應用對子宮內膜癌細胞的影響狀況。結果表明，骨化三醇和雷帕霉素單獨及聯合使用，均可使細胞周期發生變化，G0/G1期細胞增加，S期、G2/M期比例稍減少；單獨使用在G1前即可出現較低的二倍體峰細胞凋亡圖像，聯合用藥組可見G1峰前出現的較高二倍體峰細胞凋亡圖，提示凋亡率明顯增加。這一結果從抑制細胞周期增殖角度進一步為聯合用藥的協同作用提供了佐證。

雷帕霉素是最早被發現的mTOR抑制劑。有研究表明，mTOR信號通路與腫瘤的發生、發展密切相關，并與腫瘤的血管生成、轉移及化療耐藥有關[11]。雷帕霉素能結合FKBP(FK506結合蛋白)，抑制mTOR，阻止P70S6K和4EBP磷酸化，同時也間接抑制了其它相關蛋白轉錄和翻譯，具有抗菌、免疫抑制和抗腫瘤作用[12]。早在20世紀70年代，人們就發現了雷帕霉素具有抗腫瘤活性。在子宮內膜癌的發生機制研究中，Dedes等[13]認為，PI3k/Akt/mTOR是最容易出現異常激活的信號通路。作為PI3K/Akt通路的下游分子mTOR，為細胞啟動翻譯信號及細胞由G0/G1期進入S期所必需，是細胞分解和合成代謝的調節中心，與蛋白合成、細胞周期的調控相關[14]。在許多腫瘤組織培養和動物模型中，mTOR的選擇性抑制劑雷帕霉素對乳腺癌、白血病、肝細胞癌、胰腺癌、黑色素瘤、小細胞肺癌、結直腸癌等多種腫瘤均具有濃度依賴性的抑制腫瘤細胞生長活性[15]。本實驗進一步使用RT-PCR、Western blot，觀察了骨化三醇、雷帕霉素及聯合用藥組對Ishikawa細胞中Akt、mTOR mRNA及蛋白表達的影響。結果表明，單獨使用骨化三醇和雷帕霉素，Ishikawa細胞的Akt、mTOR mRNA及蛋白表達水平較對照組均有下降，但聯合用藥組下降更明顯。由此推測，骨化三醇、雷帕霉素及其聯合應用均可能通過影響PI3k/Akt/mTOR通路，下調Akt、mTOR的mRNA及蛋白的表達，影響細胞增殖周期，加速細胞凋亡，發揮抑制癌細胞作用。

我們的研究從細胞增殖抑制率、形態學、細胞增殖周期等多個層面，為骨化三醇、雷帕霉素聯合應用對子宮內膜癌細胞協同抑制效應提供了科學的依據，并初步揭示了其發揮作用的可能機制，也為臨床各領域骨化三醇、雷帕霉素及其聯合使用提供了有益的參考。