肉蓯蓉苯乙醇總苷脂質體對大鼠T6肝星狀細胞凋亡的影響及作用機制研究

馬曉婷，張石蕾，由淑萍，趙 軍，劉 濤

(新疆醫科大學 1. 公共衛生學院、2. 護理學院，新疆 烏魯木齊 830011；3. 新疆維吾爾自治區藥物研究所，新疆 烏魯木齊 830004)

肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)是一種慢性的瘢痕形成與修復過程，是發病率和死亡率都很高的世界醫學難題。HF的特點是細胞外基質過度沉積，晚期HF可診斷為肝硬化，并最終可能發展為肝衰竭，甚至肝細胞癌[1]。目前公認肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)的活化是HF進展過程中的關鍵事件[2]。在HF進程中，HSC激活成肌成纖維細胞是瘢痕形成的關鍵環節[3-4]。中醫具有治療復雜疾病及相關疾病的功效，肉蓯蓉(Cistanche)是著名的名貴補益類中藥，具有抗炎、抗病毒、抗氧化、免疫調節等作用。課題組前期研究證實，肉蓯蓉苯乙醇苷類化合物具有良好的保肝護肝作用，且其能引起Fas誘導的HSC凋亡[5]。本研究旨在探討肉蓯蓉苯乙醇總苷(phenylethanol glycosides from cistanche tubuiosa，CPhGs)脂質體對HSC凋亡的影響及其分子機制，通過靶向載藥系統轉運藥物，來克服一些藥物半衰期短、無法到達靶器官，或到達了但無法在其周圍形成有效藥物濃度等缺點，最大程度發揮藥物療效，達到長效、靶向及減輕藥物副作用等目的，期望能尋求更多的可以應用于臨床治療HF的靶向藥物治療途徑，為HF的治療提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株 大鼠HSC-T6細胞株，購自上海中喬新舟生物科技有限公司，貨號：ZQ0780。

1.1.2藥物與試劑 用薄膜分散二次包封法制備pPB修飾的肉蓯蓉總苷靶向脂質體，其粒徑為212.7 nm，電位35～50 mV，包封率(38.46±7.85)%，由本實驗室保存。胎牛血清(美國Gibco公司)；DMEM高糖培養基(美國Hyclone公司)；MTT(美國Sigma公司)；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(美國BD公司)；TRIzol Reagent(Life technologies)；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit、RIPA裂解液(賽默飛公司)；SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa公司)；蛋白定量試劑盒(Biomiga公司)；重組大鼠血小板衍生生長因子BB(recombinant rat platelet-derived growth factor BB，rrPDGF-BB) (R&D公司)；抗β-actin、JNK、p-JNK多克隆抗體(北京博奧森生物科技有限公司)。

1.1.3儀器 超凈工作臺、全波長自動酶聯免疫反應檢驗測試儀(美國Thermo Scientific公司)；CK-40型熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；低溫離心機(美國Sigma公司)； Western blot電泳裝置及轉膜裝置(美國Bio-Rad公司)；QuantStudio 6 Flex型實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養與傳代 HSC-T6在含有100 kU·L-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素和10%胎牛血清的高糖DMEM細胞培養液，于37℃、5% CO2培養箱中培養。細胞隔日換液，待生長融合至80%～90%時，使用0.25%胰蛋白酶消化收集細胞，按1 ∶2進行傳代培養，所有實驗采用對數生長期細胞。

1.2.2細胞分組 實驗分為Normal組、rrPDGF-BB組、rrPDGF-BB+CPhGs脂質體(29.45、14.72、7.36 mg·L-1)組。各組細胞均培養24 h后，收集細胞進行后續實驗。

1.2.3MTT法檢測細胞增殖 HSC-T6以5 000個/孔密度接種至96孔板，待細胞貼壁后進行分組干預，每組設3個復孔。分別培養24、48、72 h，向每孔加入10 μL MTT溶液，培養箱內37℃培養4 h后，棄去MTT溶液，再向各孔加入100 μL DMSO，置于搖床室溫搖動10 min，待結晶充分溶解后，于酶標儀492 nm波長處測定吸光度。

1.2.4流式細胞術檢測細胞凋亡 取生長狀態良好的對數生長期細胞，經胰酶消化后接種于6孔板，每孔細胞數為1×105個，24 h后按相應濃度加藥，繼續培養48 h后，每孔加入500 μL胰酶消化細胞，加完全培養液終止消化，吹打混勻移至15 mL離心管，PBS沖洗細胞，1 000 r·min-1離心5 min。棄上清，加PBS沖洗細胞2次，用AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡雙染試劑標記后，用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.5實時熒光定量PCR檢測α-SMA、Collagen I、Collagen Ⅲ mRNA的表達 TRIzol試劑盒提取HSC-T6總RNA，經純度及完整性鑒定后反轉錄反應生成cDNA。按照實時熒光定量PCR試劑盒說明書建立PCR反應體系，使用實時熒光定量PCR檢測儀進行檢測。PCR熱循環參數為：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s，共40個循環。結果分析以β-actin為內參基因，確定每個樣本、每個基因擴增的循環閾值(CT)，按照2-△△CT計算目的基因的相對表達量，所用引物序列見Tab 1。

1.2.6Western blot法分析p-JNK蛋白表達水平 收集細胞，RIPA細胞裂解液提取各組細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，取相同質量的蛋白上樣，經SDS-PAGE凝膠電泳轉移至硝酸纖維素膜，5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h，p-JNK、JNK一抗(1 ∶5 000稀釋)4℃搖床孵育過夜，TBST漂洗3次，二抗(1 ∶5 000)室溫孵育1 h，TBST漂洗3次后，化學發光顯影試劑盒(ECL)曝光顯影。利用圖像分析軟件Image J對條帶進行灰度值的測定，計算分析各組蛋白相對表達量，以p-JNK與JNK條帶信號強度的比值表示p-JNK蛋白表達水平。

Tab 1 Primer sequence of qRT-PCR

2 結果

2.1CPhGs脂質體對rrPDGF-BB刺激的HSC-T6增殖的影響Fig 1的MTT結果顯示，在24 h時，與Normal組比較，rrPDGF-BB組OD值明顯增加(P<0.05)；與rrPDGF-BB組比較，除CPhGs脂質體7.36 mg·L-1組外，其余CPhGs脂質體不同濃度組OD值均明顯下降(P<0.05)；與CPhGs脂質體7.36 mg·L-1組相比，CPhGs脂質體29.45 mg·L-1組OD值明顯降低(P<0.05)。在48、72 h時，與Normal組比較，rrPDGF-BB組和CPhGs脂質體不同濃度組OD值均明顯增加(P<0.05)；與rrPDGF-BB組比較，CPhGs脂質體不同濃度組OD值明顯下降(P<0.05)；與CPhGs脂質體7.36 mg·L-1組比較，CPhGs脂質體(14.72、29.45 mg·L-1)組OD值明顯下降(P<0.05)；與CPhGs脂質體14.72 mg·L-1組比較，CPhGs脂質體29.45 mg·L-1組OD值明顯下降(P<0.05)。結果提示，隨著藥物濃度增大和干預時間的延長，CPhGs脂質體各劑量組抑制HSC-T6增殖的作用呈現明顯的劑量-效應關系。

Fig 1 Effect of CPhGs liposome with different doses on rrPDGF-BB induced HSC-T6 proliferation n=3)

*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vsrrPDGF-BB group;△P<0.05vsrrPDGF-BB+CPhGs liposome 7.36 mg·L-1group;▲P<0.05vsrrPDGF-BB+CPhGs liposome 14.72 mg·L-1group

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2.2CPhGs脂質體對rrPDGF-BB刺激的HSC-T6凋亡的影響如Fig 2所示，與Normal組相比，rrPDGF-BB組凋亡率下降(P<0.05)；與rrPDGF-BB組相比，CPhGs脂質體不同濃度組凋亡率均明顯上升(P<0.05)；與CPhGs脂質體7.36 mg·L-1組比較，CPhGs脂質體(14.72、29.45 mg·L-1)組凋亡率明顯上升(P<0.05)；與CPhGs脂質體14.72 mg·L-1組比較，CPhGs脂質體29.45 mg·L-1組凋亡率明顯增高(P<0.05)。結果顯示，隨著CPhGs脂質體藥物濃度的升高，HSC-T6凋亡率也逐漸增高，CPhGs脂質體各劑量組間呈現劑量-效應關系。

Fig 2 Detection of apoptotic rate by flow cytometry n=3)

1：Normal；2：rrPDGF-BB；3：rrPDGF-BB+CPhGs liposome 29.45 mg·L-1；4：rrPDGF-BB+CPhGs liposome 14.72 mg·L-1；5：rrPDGF-BB+CPhGs liposome 7.36 mg·L-1.*P<0.05vsnormal group; #P<0.05vsrrPDGF-BB group;△P<0.05vsrrPDGF-BB+CPhGs liposome 7.36 mg·L-1group;▲P<0.05vsrrPDGF-BB+CPhGs liposome 14.72 mg·L-1group

2.3CPhGs脂質體對rrPDGF-BB刺激的HSC-T6α-SMA、CollagenⅠ、CollagenⅢmRNA表達的影響如Fig 3所示，與Normal組比較，α-SMA、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ mRNA在rrPDGF-BB組表達明顯增加(P<0.05)；與rrPDGF-BB組比較，α-SMA、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ mRNA在CPhGs脂質體不同濃度組表達均下降(P<0.05)；CPhGs脂質體各劑量組間比較，可見隨CPhGs脂質體濃度增大，α-SMA、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ mRNA表達明顯下降，差異具有統計學意義(P<0.05)，其中以CPhGs脂質體29.45 mg·L-1組抑制效果最明顯。

Fig 3 Effect of CPhGs liposome with different doses on rrPDGF-BB induced HSC-T6 mRNA expression of α-SMA, Collagen I and Collagen Ⅲ n=3)

*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vsrrPDGF-BB group;△P<0.05vsrrPDGF-BB+CPhGs liposome 7.36 mg·L-1group;▲P<0.05vsrrPDGF-BB+CPhGs liposome 14.72 mg·L-1group

2.4CPhGs脂質體對rrPDGF-BB刺激的HSC-T6p-JNK蛋白表達的影響如Fig 4所示，與Normal組比較，p-JNK蛋白在rrPDGF-BB和CPhGs脂質體不同濃度組表達明顯增加(P<0.05)；與rrPDGF-BB組比較，p-JNK蛋白在CPhGs脂質體不同濃度組表達下降(P<0.05)；CPhGs脂質體各劑量組間比較，p-JNK蛋白隨CPhGs脂質體干預劑量增加表達明顯下降，呈現劑量-效應關系(P<0.05)，其中以29.45 mg·L-1組效果最明顯。

3 討論

在慢性肝病中，HSC的反復激活導致HF，其特征是廣泛的瘢痕形成和干擾肝臟正常結構與功能[6]。目前，抗HF的主要策略是抑制HSC活化、增殖、收縮，誘導HSC凋亡。HSC的活化是HF的主要過程[7]，HF主要是由于細胞外基質過度沉積所致，而活化的肝HSC是細胞外基質的主要來源。

Fig 4 Effect of CPhGs liposome with different doses on rrPDGF-BB induced HSC-T6 protein

1：Normal；2：rrPDGF-BB；3：rrPDGF-BB+CPhGs liposome 29.45 mg·L-1；4：rrPDGF-BB+CPhGs liposome 14.72 mg·L-1；5：rrPDGF-BB+CPhGs liposome 7.36 mg·L-1.*P<0.05vsnormal group; #P<0.05vsrrPDGF-BB group;△P<0.05vsrrPDGF-BB+CPhGs liposome 7.36 mg·L-1group;▲P<0.05vsrrPDGF-BB+CPhGs liposome 14.72 mg·L-1group

肝損傷后，HSC經歷一個復雜的從靜止狀態向肌成纖維細胞轉換或激活過程，α-SMA是HSC活化的標志物，α-SMA在肌成纖維細胞分化中起作用。α-SMA降低了收縮力和Collagen I合成，并抑制傷口收縮。Collagen I和α-SMA被認為是HF中誘導HSC活化的標志物，可以減少α-SMA的含量，促進HSC凋亡，逆轉HF進程。宋陽等[8]的研究結果證實，其研究的藥物可明顯抑制HSC的增殖，促進其凋亡，并使α-SMA蛋白表達明顯降低，以此降低細胞外基質的沉積，從而起到逆轉HF的作用。由淑萍等[9]研究表明，肉蓯蓉苯乙醇總苷可以抑制rrPDGF-BB誘導的HSC增殖。上述研究結果提示，抑制HSC的激活和增殖，促進HSC凋亡已成為阻止HF發生、發展的關鍵事件。最近的臨床實驗證據也提示，HF具有可逆性的[10]。HF的逆轉與HSC的凋亡有著密切關聯。HF逆轉期，活化的 HSC數量減少主要依靠細胞凋亡，而不是活化狀態細胞向靜止狀態轉化。細胞凋亡是細胞的主動“自殺”過程，與壞死不同，細胞凋亡發生于HF的產生和發展過程中。HSC凋亡在HF發展過程中不僅起著主動作用，而且貫穿整個纖維化形成的過程。本研究用不同濃度的CPhGs脂質體藥物作用于HSC-T6 48 h后，用流式細胞儀檢測細胞凋亡，結果顯示，與Normal組相比，rrPDGF-BB組凋亡率下降，CPhGs脂質體(29.45、14.72 mg·L-1)組凋亡率上升，與rrPDGF-BB組相比，CPhGs脂質體不同濃度組凋亡率均明顯上升，且CPhGs脂質體不同濃度組相比，差異具有統計學意義。實驗結果表明，CPhGs脂質體可誘導HSC-T6的凋亡，且凋亡程度與CPhGs脂質體濃度存在聯系，CPhGs脂質體各劑量組間表現出明顯的劑量-效應關系。

HF是指結締組織過度增殖和異常沉積，特別是膠原蛋白、非膠原蛋白和肝小葉門管區的蛋白多糖等。因此，細胞外基質降解和生成之間的不平衡是HF發生與發展的關鍵因素。因此，保護肝細胞，促進肝再生，保持膠原蛋白的正常代謝也成為預防和治療HF的重要措施。人類有19種膠原蛋白，在肝臟中存在的有5種類型，在HF的總蛋白中膠原蛋白約占50%，主要涉及Collagen I和Collagen Ⅲ。在肝臟中，Collagen I占60%～70%，Collagen Ⅲ占20%～30%，是構成細胞外基質的主要成分。因此，Collagen I和Collagen Ⅲ被認為是反映膠原蛋白在肝臟中進行新陳代謝的重要參數。李偉偉等[11]的研究結果顯示所研究藥物可通過抑制CollagenⅢ沉積而起到抗HF作用。張揚武等[12]的實驗結果也證實了可通過抑制HSC的活化，降低Collagen I的表達,達到逆轉HF的作用。本研究采用實時熒光定量PCR檢測α-SMA、Collagen I 和 Collagen Ⅲ基因表達，研究結果顯示，與Normal組相比，rrPDGF-BB組α-SMA、Collagen I、Collagen Ⅲ mRNA表達明顯增高，與rrPDGF-BB組相比，不同濃度的CPhGs脂質體組均可不同程度下調α-SMA、Collagen I 和 Collagen Ⅲ的mRNA表達，其中29.45 mg·L-1CPhGs脂質體組下調作用最明顯，且隨著藥物濃度的升高，其下調程度越明顯。我們認為產生這種現象的原因在于濃度越高，其對rrPDGF-BB引起的HSC增殖的抑制效果越明顯，越趨近于正常。因此，我們認為其能抑制HSC增殖，促進其凋亡，以此來阻止HF的形成。

JNK已顯示對不同細胞類型的細胞增殖有積極的調節作用，JNK通過負性調節作用來抑制靜止HSC的活化，從而阻止HSC的增殖，刺激MAPK信號通路，從而使其下游通路阻斷，起到預防HF的作用。本研究結果顯示，與Normal組比較，rrPDGF-BB組p-JNK的蛋白表達量明顯增高，表明rrPDGF-BB可通過影響MAPK信號，使HSC活化增殖。不同濃度的CPhGs脂質體組，p-JNK的蛋白表達量隨著藥物濃度的升高逐漸降低，且不同濃度的CPhGs脂質體組p-JNK的蛋白表達量與rrPDGF-BB組比較，差異均有統計學意義。由此可見，CPhGs脂質體可在一定程度上抑制rrPDGF-BB誘導的HSC增殖與活化，促進HSC凋亡，從而抑制HF的發生、發展。本研究結果為后續實驗進一步研究CPhGs脂質體抗HF作用機制提供了扎實的理論基礎。期望能夠尋求更多抗HF的靶向給藥途徑，給HF患者帶來福音。

(致謝：本實驗主要在新疆醫科大學2011協同中心完成，在此特別感謝姜平、盛磊老師提供的支持與幫助，對王志強師兄和張石蕾師姐提供的幫助及指導表示衷心感謝！)