砷中毒地區(qū)女性妊娠結(jié)局及生殖系統(tǒng)疾病生物學(xué)標(biāo)志物的研究

馮琳，張瑗，孟玉春，楊靜逸，孫瀏，余雄武

（1.云南省曲靖市婦幼保健院 婦一科，云南 曲靖 655000；2.云南省曲靖市婦幼保健院產(chǎn)二科，云南 曲靖 655000；3.云南舜喜再生醫(yī)學(xué)工程有限公司研究中心，云南 昆明650000；4.云南省曲靖市婦幼保健院 普外科，云南 曲靖 655000）

單質(zhì)砷和砷的化合物已被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（International Agency for Research on Cancer, IARC）明確認(rèn)定為人類確定致癌物[1]。國(guó)外流行病學(xué)研究人員通過流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，慢性飲水型砷暴露與全身各系統(tǒng)非惡性疾病及惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[2-3]。據(jù)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道提示長(zhǎng)期低劑量接觸砷可以引發(fā)多種疾病，如人體皮膚色素沉著、色素分布異常，皮膚角化過度或角化不全，外周神經(jīng)病變、腦血管及周圍血管病變，生殖功能障礙和全身各器官的腫瘤等[4-5]。本文通過測(cè)定砷暴露地區(qū)女性的生殖系統(tǒng)生物標(biāo)志物的水平，初步探討砷暴露對(duì)女性生殖系統(tǒng)的損傷。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象及分組

收集2014年曲靖某砷中毒地區(qū)成年女性（18歲及以上）6424例相關(guān)資料，平均年齡（28±3）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)為在砷暴露地區(qū)居住超過15年的女性，排除標(biāo)準(zhǔn)為接觸砷及其砷化物的相關(guān)職業(yè)人員。所有研究對(duì)象都符合納入標(biāo)準(zhǔn)并且簽署知情同意書。按照我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定飲水砷衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)和我國(guó)曲靖地區(qū)地下水含砷的水平以及參考文獻(xiàn)[6]后，將研究對(duì)象按飲水砷濃度不同，分成低砷暴露組（0.01 mg/L≤飲水砷濃度＜0.1 mg/L）（1922例），高砷暴露組（飲水砷濃度≥0.1 mg/L）（1502例），非砷暴露地區(qū)的成年女性（18歲及以上）作為對(duì)照組，飲水砷濃度＜0.01 mg/L（3000例）。

1.2 主要試劑和儀器設(shè)備

雌二醇（Estradiol, E2）、孕激素（Progesterone,P4）、黃體生成素（Luteinizinghormone, LH）（南京建成生物工程研究所），ER單克隆抗體、PR單克隆抗體，（福建邁新生物技術(shù)有限公司），濃縮型DAB試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），磷酸鹽緩沖液（PBS）（美國(guó)Hyclone公司），中性樹膠（北京索萊寶科技有限公司），無水乙醇（天津開通化學(xué)試劑有限公司），二甲苯（天津市開通化學(xué)試劑有限公司），蘇木素（北京索萊寶科技有限公司），甲醇（天津市開通化學(xué)試劑有限公司），雙氧水H2O2（天津市開通化學(xué)試劑有限公司）。ASA-2SP砷形態(tài)分析儀（日本島津公司），原子吸收分光光度計(jì)（德國(guó)耶拿公司），SRAF-16C型電磁爐（日本Shimadzu公司），顯微鏡（德國(guó)Hund公司）。

1.3 標(biāo)本的采集及檢測(cè)

1.3.1 尿樣、血樣的采集與檢測(cè) 留取研究對(duì)象尿液20 ml左右貯存于潔凈試管中，冷藏運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，置于-20℃冰箱冷凍待測(cè)。取研究對(duì)象的中段尿4 ml于潔凈的10 ml玻璃試管中，向尿樣試管中加入2 mol/L的氫氧化鈉8 ml，混勻、高溫（100℃）加熱3 h，震蕩1次/h?，F(xiàn)場(chǎng)采取研究對(duì)象血液5 ml置于采血管中，冷藏運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，置于-20℃冰箱冷凍待測(cè)。嚴(yán)格按照E2、P4、LH試劑盒說明說操作，檢測(cè)相應(yīng)的激素水平。原子吸收分光光度計(jì)（193.7 nm）測(cè)定待測(cè)血液和尿液中的砷含量。

1.3.2 子宮和卵巢樣本的采集 通過穿刺方式采集活檢標(biāo)本經(jīng)4%甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。

1.4 研究方法

1.4.1 砷含量及血中雌激素水平檢測(cè) 用氫原子吸收分光光度法測(cè)定尿液中和外周血中砷的含量。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血中砷含量及雌激素水平。

1.4.2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè) 子宮和卵巢中雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）含量采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)：①切片：將石蠟包埋組織作4μm厚連續(xù)切片；②烤片：切片置于60℃溫箱內(nèi)過夜；③脫蠟：常規(guī)3級(jí)二甲苯脫蠟5min，5級(jí)梯度酒精至水1min，蒸餾水沖洗3min，沖洗3次；④阻斷：3% H2O2甲醇溶液，室溫孵育15min，PBS沖洗3min/次，沖洗3次；⑤抗原修復(fù)（高溫高壓加熱法）：將修復(fù)液置于不銹鋼高壓鍋中煮開，將水化好的組織片浸沒在修復(fù)液中，煮沸1～2min后，冷卻；⑥封閉：切片加1滴正常非免疫動(dòng)物血清，室溫下孵育10min；⑦加一抗和二抗：切片加1滴一抗（ER、PR單克隆抗體）置于濕盒中4℃電冰箱中過夜，PBS沖洗3min，沖洗3次；加1滴生物素標(biāo)記的二抗體，置于濕盒中4℃孵育30min，PBS沖洗3min，沖洗3次；加一滴鏈霉素抗生物素一過氧化物酶溶液，置于濕盒中4℃孵育30min，PBS沖洗3min，沖洗3次；⑧顯色：切片1滴加新鮮配置的DAB溶液，顯微鏡下觀察顯色情況，適時(shí)終止反應(yīng)；⑨復(fù)染、分化、返藍(lán)：切片蘇木素復(fù)染4min，清水沖洗，鹽酸酒精分化10s，清水沖洗返藍(lán)，直至核呈藍(lán)色，酒精脫水，二甲苯透明，干燥，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察結(jié)果。陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)：ER、PR免疫組織化學(xué)染色以細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為其陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用例（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，多個(gè)率兩兩比較采用χ2分割法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組妊娠異常及生殖系統(tǒng)腫瘤情況比較

高砷暴露組女性妊娠期出現(xiàn)妊娠高血壓和妊娠期不良妊娠結(jié)局的概率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=13.698和9.394，P=0.002和0.007）；高砷暴露組女性生殖系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=17.324，P=0.001）。見表 1。

表1 各組妊娠異常及生殖系統(tǒng)腫瘤情況的比較 例（%）

2.2 各組血砷和尿砷含量比較

各組女性的血砷和尿砷含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；組間兩兩比較顯示高砷暴露組和低砷暴露組的血砷和尿砷含量高于對(duì)照組（t=9.471、12.575、8.484和10.537，P=0.007、0.003、0.011和 0.005）；高砷暴露組的血砷和尿砷含量高于低砷暴露組（t=7.463和11.486，P=0.012和0.004），且隨著砷暴露濃度增高，女性的血砷和尿砷呈增高的趨勢(shì)，存在劑量-效應(yīng)關(guān)系。見表2。

表2 各組血砷和尿砷含量比較 （μg/L，±s）

表2 各組血砷和尿砷含量比較 （μg/L，±s）

注：1）與對(duì)照組比較，P ＜0.05；2）與低砷暴露組比較，P ＜0.05

組別 血砷 尿砷對(duì)照組（n =3 000） 6.93±0.89 35.09±4.21低砷暴露組（n =1 922） 15.31±1.381） 43.77±5.371）高砷暴露組（n =1 502） 19.22±1.521）2） 56.76±3.781）2）F值 17.571 6.473 P值 0.001 0.026

2.3 砷暴露對(duì)女性雌激素E2、P4、LH的影響

各組女性的E2、P4、LH水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），高砷暴露組和低砷暴露組女性體內(nèi)的E2、P4、LH水平低于對(duì)照組（t=17.558、8.458、8.478、12.558、9.455 和 11.948，P=0.000、0.011、0.011、0.003、0.009和0.003）；高砷暴露組女性體內(nèi)的E2、P4、LH水平低于低砷暴露組（t=17.561、7.982和9.482，P=0.001、0.012和0.007），且隨著砷暴露濃度增高，女性體內(nèi)的E2、P4、LH呈降低的趨勢(shì)。見表3。

表3 砷暴露對(duì)女性雌激素E2、P4、LH的影響（pg/ml，±s）

表3 砷暴露對(duì)女性雌激素E2、P4、LH的影響（pg/ml，±s）

注：1）與對(duì)照組比較，P ＜0.05；2）與低砷暴露組比較，P ＜0.05

組別 E2 P4 LH對(duì)照組（n =3 000） 55.12±2.82 36.23±1.65 64.39±3.96低砷暴露組（n =1922） 42.04±1.851） 30.32±1.331） 32.24±2.131）高砷暴露組（n =1 502） 10.56±1.301）2） 22.45±1.311）2） 21.57±2.631）2）F值 18.218 17.656 8.473 P值 0.001 0.001 0.011

2.4 雌激素受體蛋白ER、PR在各組女性子宮和卵巢中的表達(dá)

各組女性子宮和卵巢中雌激素受體蛋白ER、PR差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；高砷暴露組和低砷暴露組女性子宮和卵巢中雌激素受體蛋白ER、PR水平高于對(duì)照組，（t=18.478、12.558、25.455、11.948、53.089、10.488、48.937 和 9.948，P=0.001、0.003、0.000、0.002、0.000、0.005、0.000和0.006）；高砷暴露組女性子宮和卵巢中雌激素受體蛋白ER、PR水平高于低砷暴露組（t=12.982、11.685、39.089和36.687，P=0.003、0.003、0.000和0.000）；在低砷暴露組和高砷暴露組女性的子宮和卵巢中出現(xiàn)ER、PR高表達(dá)的情況。見表4和圖1～4。

表4 各組女性子宮和卵巢中雌激素受體蛋白ER、PR的表達(dá)比較 （±s）

表4 各組女性子宮和卵巢中雌激素受體蛋白ER、PR的表達(dá)比較 （±s）

注：1）與對(duì)照組比較，P ＜0.05；2）與低砷暴露組比較，P ＜0.05

卵巢ER PR ER PR對(duì)照組（n =3 000） 5.35±0.83 6.43±0.69 5.89±0.98 4.59±0.85低砷暴露組（n =1 922） 20.23±1.761） 25.29±2.351） 18.32±2.251） 15.28±1.591）高砷暴露組（n =1 502） 50.51±6.281）2） 62.35±8.351）2） 85.09±7.651）2） 80.21±5.631）2）F值 6.469 7.421 17.519 17.569 P值 0.026 0.021 0.001 0.001子宮組別

圖1 女性子宮ER表達(dá) （×200）

圖2 女性子宮PR表達(dá) （×200）

圖3 女性卵巢ER表達(dá) （×200）

圖4 女性卵巢PR表達(dá) （×200）

3 討論

大量研究表明[7-8]，砷作為內(nèi)分泌干擾物可對(duì)女性的生殖系統(tǒng)有嚴(yán)重的毒性，長(zhǎng)期砷暴露可改變女性排卵周期，使生殖系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生率明顯增加；長(zhǎng)期砷暴露還會(huì)對(duì)女性妊娠造成影響，引發(fā)妊娠高血壓及妊娠高血壓并發(fā)心臟病的發(fā)生率明顯增加，易引起早產(chǎn)、流產(chǎn)、死產(chǎn)等不良妊娠結(jié)局；長(zhǎng)期砷暴露還有一定的生殖毒性，嚴(yán)重者還會(huì)增加胎兒畸形的發(fā)生率。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也表明[9-10]，砷暴露可使雌性動(dòng)物的卵巢和子宮重量降低，雌激素、孕激素分泌紊亂。本研究結(jié)果提示，砷暴露均可使女性體內(nèi)的血砷和尿砷有不同程度的增加，且有明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。在同一水砷濃度暴露水平下，高暴露組中女性二甲基砷酸（DMA）、總砷（TAs）含量以及一甲基化率（SMR）水平高于男性；低暴露組和對(duì)照組無機(jī)砷（As）、DMA、TAs含量、SMR水平在不同性別間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[11]，這與本研究的結(jié)果具有一致性。

砷及其砷化物是一類環(huán)境雌激素物質(zhì)[12]，能夠干擾或模擬內(nèi)源性雌激素作用，競(jìng)爭(zhēng)性的與下丘腦、卵巢、子宮等臟器上的相應(yīng)雌激素受體結(jié)合，干擾體內(nèi)雌激素的正常作用與水平，破壞內(nèi)分泌環(huán)境的平衡，從而影響生殖系統(tǒng)的健康生長(zhǎng)與正常發(fā)育，最終可導(dǎo)致一系列腫瘤的發(fā)生[13]，對(duì)雌激素的干擾途徑也各不相同[14]。破壞內(nèi)分泌微環(huán)境的平衡，誘導(dǎo)或抑制人體自然雌激素分泌的水平。本研究顯示，砷暴露地區(qū)女性的體內(nèi)雌激素水平處于低水平，并且砷暴露地區(qū)生殖系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生率較高。

砷作為一種潛在的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物（EDCs），低劑量即可與類固醇激素受體（SHRs）優(yōu)先結(jié)合，干擾活化的類固醇激素（孕激素、雌激素）的生物學(xué)作用，并且能夠作為轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合，從而調(diào)控基因的表達(dá)水平[15]。砷可對(duì)ER、PR存在共同的作用途徑，砷可使這些受體產(chǎn)生復(fù)雜的劑量依賴效應(yīng)，如低劑量砷暴露（0.1～1.0 μmol/L）可增強(qiáng)激素依賴性基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)；而高劑量砷暴露（1.0～5.0 μmol/L）卻可以抑制激素依賴性基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，提示砷可通過調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄與表達(dá)而發(fā)揮作用[15-17]。劉曉霞等[18]研究發(fā)現(xiàn)，ER與雌激素結(jié)合后活化，參與基因轉(zhuǎn)錄，要么直接誘導(dǎo)靶基因轉(zhuǎn)錄，要么通過其他方式誘導(dǎo)靶基因轉(zhuǎn)錄，從而通過對(duì)靶基因的調(diào)控而發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。砷可通過干擾激素與激素受體的結(jié)合而擾亂激素的分泌及發(fā)揮其生物學(xué)作用。本研究結(jié)果提示，砷可以使激素受體蛋白ER、PR的表達(dá)紊亂，影響女性的生殖健康。體外實(shí)驗(yàn)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提示[19-20]砷具有雌激素樣的作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提示大鼠及小鼠動(dòng)情周期紊亂，雌性小鼠子宮和卵巢的ER和PR mRNA表達(dá)水平降低。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)提示0.5 μmol/L As2O3對(duì)Hela細(xì)胞的ERa及PR mRNA表達(dá)水平的影響與1mmol/L的雌二醇對(duì)Hela細(xì)胞的ERa及PR mRNA表達(dá)水平的影響相似，且它們的作用均可被雌二醇拮抗劑所拮抗。

血砷、尿砷可以作為砷暴露地區(qū)女性生殖系統(tǒng)損害的暴露標(biāo)志物，E2、P4、LH、ER、PR可作為效應(yīng)標(biāo)志物。在今后的研究中，應(yīng)該加強(qiáng)對(duì)砷中毒病區(qū)的流行病調(diào)查，同時(shí)還可以開展大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及體外實(shí)驗(yàn)，并且運(yùn)用分子生物技術(shù)監(jiān)測(cè)分析砷中毒發(fā)病及相關(guān)生物標(biāo)志物，從遺傳流行病學(xué)及分子流行病學(xué)方面分析砷中毒的生物標(biāo)志物，為揭示砷中毒發(fā)病的分子機(jī)制，為防治砷中毒提供可靠的理論依據(jù)。