野葛花黃酮和花青素的提取及抗氧化性研究

（延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西延安716000）

野葛花是豆科葛屬植物野葛（Pueraria lobata（Willd.）Ohwi）的花，呈藍(lán)紫色，具有解酒醒脾保肝的功效[1-3]。研究表明，野葛花主要成分為黃酮類(lèi)、皂苷類(lèi)、揮發(fā)油類(lèi)、甾醇類(lèi)、生物堿和氨基酸等，其中以黃酮類(lèi)成分含量最高[4-5]。黃酮類(lèi)化合物主要分布在植物的花、葉、果部位，具有抗氧化、抑菌消炎、抗腫瘤、抗衰老等多種功能[6]。花青素屬于黃酮類(lèi)化合物，是構(gòu)成花瓣和果實(shí)顏色的主要色素之一，常見(jiàn)于花、果實(shí)的組織中及莖葉的表皮細(xì)胞與下表皮層[7]，具有較強(qiáng)的抗氧化、抗突變、保護(hù)肝臟、降血糖和抗發(fā)炎等功效[8-10]。野葛花長(zhǎng)期作為我國(guó)的傳統(tǒng)藥物使用，其他方面的應(yīng)用較少，尤其是野葛花中花青素類(lèi)黃酮化合物的研究報(bào)道還不多見(jiàn)，對(duì)花青素提取的已有研究也是采用酶法[11]或傳統(tǒng)浸提法[12]，這兩種方法提取率較低。超聲波作為一種輔助提取方法，通過(guò)增大溶劑分子的運(yùn)動(dòng)速度和穿透力，加快細(xì)胞破碎的速度，使溶劑快速的滲透到細(xì)胞中，提高有效成分的提取率和純度[13]。基于此，本試驗(yàn)選用超聲輔助乙醇提取野葛花黃酮和花青素，優(yōu)化其最佳提取工藝條件，并初步研究了黃酮和花青素提取物的抗氧化性，以期為其綜合開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

野葛花：江西上饒深山。

乙醇、蘆丁、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、抗壞血酸、水楊酸（分析純）：天津市福晨化學(xué)試劑廠。

1.1.2 儀器與設(shè)備

WG-71型電熱鼓風(fēng)干燥箱、FW177型中草藥粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；JA3003型電子分析天平：上海舜宇恒平科技儀器有限公司；721型可見(jiàn)分光光度計(jì)：浙江賽德儀器設(shè)備有限公司；DK-98-ⅡA型電熱恒溫水浴鍋：上海百典儀器設(shè)備有限公司；YRE-2010-Ⅱ型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵：上海皖寧精密科學(xué)儀器有限公司；BL3-120型超聲波清洗儀：上海比朗儀器制造有限公司。

1.2 黃酮提取試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

參照郭京波[14]的方法制作和繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.010x+0.005，回歸方差為R2=0.999。

1.2.2 野葛花黃酮提取和測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取1.00 g葛花粉末多份，置于250 mL錐形瓶中，按一定的液料比加入60%乙醇溶液，將錐形瓶放入恒溫水浴鍋內(nèi)超聲（300 W）輔助浸提，提取，然后用真空泵抽濾，將濾液倒入100 mL容量瓶，暫時(shí)保存。再將濾渣按相同條件進(jìn)行二次提取，抽濾后用乙醇定容至100 mL容量瓶中，得黃酮提取液。采用Na（NO2）-Al（NO3）3-NaOH法測(cè)定黃酮[15]。根據(jù)回歸方程計(jì)算出提取液中黃酮的質(zhì)量濃度，然后計(jì)算野葛花中黃酮得率（%），公式為：

式中：C為提取液中總黃酮濃度，mg/mL；V為定容體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；W為稱(chēng)量的野葛花質(zhì)量，g。

1.2.3 單因素試驗(yàn)和正交優(yōu)化

分別考察了料液比、提取時(shí)間和溫度3個(gè)因素對(duì)野葛花黃酮得率的影響。首先，在料液比分別為1∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50（g/mL），提取時(shí)間 90 min，提取溫度50℃的條件下，考察料液比對(duì)黃酮得率的影響；其次，在提取時(shí)間分別為 90、100、110、120、130 min，料液比1∶30（g/mL），提取溫度50℃的情況下，考察提取時(shí)間對(duì)花青素得率的影響；最后，在提取溫度分別為 30、40、50、60、70 ℃，料液比 1 ∶30（g/mL），提取時(shí)間90 min條件下，考察提取溫度對(duì)黃酮得率的影響。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇料液比、提取時(shí)間和提取溫度3個(gè)因素的各3個(gè)較優(yōu)水平進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，對(duì)野葛根黃酮的提取工藝進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化。

1.3 花青素提取試驗(yàn)方法

1.3.1 野葛花花青素提取和測(cè)定

稱(chēng)取1.00 g野葛花粉末，加乙醇溶液（pH=3.0）超聲（300 W）輔助浸提、抽濾后，50℃減壓濃縮，之后用蒸餾水定容至100 mL得花青素提取液。采用pH值示差法測(cè)定花青素含量[16]。花青素溶液在525 nm處有最大吸收，選擇1.0和4.5兩個(gè)pH值對(duì)花青素溶液進(jìn)行定量分析，計(jì)算溶液中花青素得率，公式為：

式中：M=449.2，是矢車(chē)菊-3-葡萄糖苷的相對(duì)分子質(zhì)量；ε=29 600，為矢車(chē)菊-3-葡萄糖苷的消光系數(shù)；DF為取樣測(cè)定時(shí)的稀釋倍數(shù)；V為總的提取溶液體積，L；W為稱(chēng)量的野葛花質(zhì)量，g。

1.3.2 單因素試驗(yàn)和正交優(yōu)化

分別考察提取溫度、乙醇濃度、提取時(shí)間和料液比4個(gè)因素對(duì)野葛花花青素提取得率的影響。首先，在提取溫度分別為 30、40、50、60、70 ℃，乙醇濃度60%，料液比為1∶30（g/mL），提取時(shí)間 60 min的情況下，考察提取溫度對(duì)花青素得率的影響；其次，在乙醇濃度分別為40%、50%、60%、70%、80%，料液比為1∶30（g/mL），提取時(shí)間 60 min，提取溫度 60℃條件下，考察乙醇濃度對(duì)花青素得率的影響；再次，在提取時(shí)間分別為 60、80、100、120、140 min，乙醇濃度 60%，料液比為1∶30（g/mL），提取溫度60℃的情況下，考察提取時(shí)間對(duì)花青素得率的影響；最后，在料液比分別為 1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30、1 ∶35（g/mL），乙醇濃度60%，提取時(shí)間60 min，提取溫度60℃的情況下，考察了料液比對(duì)花青素得率的影響。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇提取溫度、乙醇濃度、提取時(shí)間及料液比4個(gè)因素的各3個(gè)較優(yōu)水平進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，確定野葛根花青素的最佳提取工藝參數(shù)。

1.4 羥基自由基清除試驗(yàn)

野葛花黃酮、花青素及VC對(duì)羥基自由基的清除率，采用水楊酸法[17]進(jìn)行測(cè)定。對(duì)羥基自由基的清除率按下式計(jì)算：

式中：A0為空白對(duì)照液的吸光值；Am為分別加入黃酮、花青素及VC后的吸光值；An為不加H2O2時(shí)的吸光值。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)經(jīng)Excel2003、SPSS19.0等軟件進(jìn)行整理、分析與作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 野葛花黃酮的提取工藝

料液比、提取時(shí)間和溫度對(duì)野葛花黃酮得率的影響見(jiàn)圖1。

圖1 料液比、提取時(shí)間和溫度對(duì)野葛花黃酮得率的影響Fig.1 Effect of solid/liquid ratio，extraction time and extraction temperature on the flavonoids yield of Flos Puerariae

由圖1的單因素試驗(yàn)結(jié)果可知，料液比、提取時(shí)間、提取溫度對(duì)野葛花黃酮得率均有明顯影響作用。黃酮得率隨料液比增加逐漸增加，在1∶30（g/mL）時(shí)達(dá)到最大值，之后略有下降；隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)和提取溫度的升高，黃酮得率分別在100 min和40℃時(shí)達(dá)到最大值，之后明顯下降。由此確定，提取野葛花黃酮的單因素水平應(yīng)分別控制在料液比1∶30（g/mL），提取時(shí)間100 min，提取溫度40℃為宜。

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定料液比、提取時(shí)間和提取溫度的 3 個(gè)水平 [1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40（g/mL）；100、110、120 min；30、40、50 ℃]進(jìn)行正交試驗(yàn)（表1）。

表1 野葛花黃酮提取正交優(yōu)化結(jié)果Table 1 Results of orthogonal experiment of flavonoids of Flos Puerariae

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各因素對(duì)野葛花黃酮得率的影響效果依次為料液比（A）＞提取時(shí)間（B）＞提取時(shí)間（C），最佳提取工藝為 A2B2C2，即料液比 1 ∶30（g/mL），提取時(shí)間110 min，提取溫度40℃。驗(yàn)證試驗(yàn)表明，在此條件下黃酮得率為2.84%。

2.2 野葛花花青素提取工藝

野葛花花青素提取的單因素試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 提取溫度、乙醇濃度、提取時(shí)間和料液比對(duì)野葛花花青素得率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature，ethanol concentration，extraction time and solid/liquid ratio on the anthocyanins yield of Flos Puerariae

隨著乙醇濃度的升高，花青素得率逐漸上升，在70%時(shí)達(dá)到最大值，之后明顯下降；料液比、提取溫度和提取時(shí)間的變化規(guī)律相似，隨著3個(gè)因素水平的增加，花青素得率均先上升之后略有下降，分別在1∶30（g/mL）、60℃和120 min時(shí)達(dá)到最大值。由此確定，提取野葛花花青素的單因素水平應(yīng)分別控制在乙醇濃度70%，料液比1∶30（g/mL），提取溫度60℃，提取時(shí)間120 min為宜。

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定提取溫度（50、60、70℃）、乙醇濃度（50%、60%、70%）、提取時(shí)間（100、120、140 min）和料液比[1 ∶25、1 ∶30、1 ∶35（g/mL）]的 3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。野葛花花青素提取正交優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 野葛花花青素提取正交優(yōu)化結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiment of anthocyanins of Flos Puerariae

續(xù)表2 野葛花花青素提取正交優(yōu)化結(jié)果Continue table 2 Results of orthogonal experiment of anthocyanins of Flos Puerariae

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各因素對(duì)野葛花花青素得率的影響效果依次為提取溫度（A）＞乙醇濃度（B）＞料液比（D）>提取時(shí)間（C），最佳提取工藝為A2B2C2D2，即提取溫度60℃，乙醇濃度60%，提取時(shí)間120min，料液比1∶30（g/mL）。驗(yàn)證試驗(yàn)表明，在此條件下花青素得率為2.17%。

2.3 對(duì)羥基自由基的清除作用

野葛花黃酮和花青素對(duì)羥基自由基的清除率見(jiàn)圖3。

圖3 野葛花黃酮和花青素對(duì)羥基自由基的清除率Fig.3 The hydroxy radical scavenging rate of the flavonoids and anthocyanins from Flos Puerariae

由圖3可知，在一定范圍內(nèi)，隨著濃度增加，野葛花黃酮、花青素和抗壞血酸對(duì)羥基自由基清除率均逐漸增強(qiáng)，說(shuō)明三者對(duì)羥基自由基的清除能力均存在著一定的量效關(guān)系。在相同質(zhì)量濃度下，野葛花黃酮對(duì)羥基自由基具有較好的清除作用，效果高于花青素；野葛花黃酮和花青素對(duì)羥基自由基的清除效果明顯高于抗壞血酸。

3 討論

黃酮類(lèi)物質(zhì)是野葛花的重要成分之一。本試驗(yàn)利用超聲輔助乙醇提取法測(cè)定野葛花黃酮的含量，通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化其工藝條件，在最佳提取條件下野葛花黃酮得率為2.84%，相比同類(lèi)傳統(tǒng)提取方法，超聲輔助提取黃酮得率明顯高于傳統(tǒng)蘆丁提取法（1.61%）[12]，但低于超聲輔助萃取葛花總黃酮得率（5.19%）[18]。這可能與試驗(yàn)材料不同，采用的標(biāo)準(zhǔn)品以及提取方法不同有關(guān)。超聲波會(huì)導(dǎo)致植物細(xì)胞破裂，加速細(xì)胞中有效成分溶出，縮短提取時(shí)間和降低溶劑使用量，提高經(jīng)濟(jì)效益。可見(jiàn)，超聲輔助提取法有助于提高黃酮提取物得率，為后續(xù)野葛黃酮的工業(yè)化提取奠定了理論基礎(chǔ)。

花青素屬于黃酮類(lèi)化合物，但是其立體結(jié)構(gòu)和性質(zhì)隨pH值和溫度的變化而變化，導(dǎo)致其呈現(xiàn)不同顏色[7，19]。因此，花青素和黃酮的測(cè)定方法雖有相似之處，但是提取工藝側(cè)重點(diǎn)不同。本試驗(yàn)利用pH值示差法檢測(cè)花青素，并采用超聲輔助來(lái)提高花青素的浸提得率，通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化得出花青素得率高達(dá)2.17%，略高于酶法浸提法得到的盛花期葛花花青素得率（2.12%）[12]。研究表明，超聲輔助浸提花青素的效率比相同條件下熱浸提（70℃）提高50%以上[20]。可見(jiàn)，超聲輔助提取法有助于提高花青素得率。花青素活性較高，穩(wěn)定性較差，作為一種天然食用色素，安全性高，資源豐富，但富含花青素的原材料價(jià)格較高[21-22]，而野葛在我國(guó)分布很廣，繁殖能力很強(qiáng)且花期較長(zhǎng)，野葛花中含有豐富的花青素，可以作為花青素的廉價(jià)原材料，用于開(kāi)發(fā)天然食用色素。

黃酮和花青素的分子結(jié)構(gòu)決定了其抗氧化性強(qiáng)弱。黃酮和花青素均含有酚羥基，酚羥基能夠提供質(zhì)子直接參與自由基的清除，清除自由基的能力與酚羥基的數(shù)目有關(guān)，酚羥基數(shù)目越多，供氫能力越強(qiáng)，去除自由基的能力就越強(qiáng)[23-25]。黃酮B環(huán)上的羥基提供質(zhì)子的能力最強(qiáng)，是黃酮分子清除自由基，發(fā)揮抗氧化活性的主要部位[26-27]。花青素含有多個(gè)酚羥基，且含有多個(gè)酰化基團(tuán)，酰基化花青素結(jié)構(gòu)中的孤對(duì)電子可以作為氫供體，因而具有清除活性氧自由基的能力，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化性[28]。本試驗(yàn)結(jié)果表明野葛花黃酮和花青素對(duì)羥基自由基的清除效果明顯優(yōu)于抗壞血酸，且清除作用與濃度呈劑量關(guān)系，野葛花黃酮和花青素具有較強(qiáng)的抗氧化性。這與紫色甘薯花色苷對(duì)羥自由基的抗氧化能力[29]以及葛花、秀麗槭葉等總黃酮的抗氧化能力[30-31]研究結(jié)果一致。可見(jiàn)，野葛花是具有開(kāi)發(fā)應(yīng)用潛力的野生植物源天然抗氧化劑，在食品保質(zhì)保鮮等方面表現(xiàn)出極大的開(kāi)發(fā)潛能。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)超聲輔助乙醇提取野葛花中黃酮，其最佳工藝條件為料液比為1∶30（g/mL）、提取溫度為40℃、提取時(shí)間為110 min，野葛花黃酮最佳得率為2.84%。利用超聲輔助pH示差法提取野葛花花青素，其最佳工藝條件為乙醇濃度60%，料液比1∶30（g/mL），時(shí)間120 min，溫度60℃時(shí)，花青素含量高達(dá)2.17%。野葛花黃酮和花青素對(duì)羥自由基的清除效果明顯優(yōu)于抗壞血酸，且清除作用與濃度呈劑量關(guān)系。本研究結(jié)果可為開(kāi)發(fā)應(yīng)用野生植物源天然抗氧化劑提供理論支撐。