不同產地諾麗發酵汁功效成分分析及評價

周偏，梁叢穎，烏日娜，蔡坤，劉四新，李從發，*

（1.海南大學食品學院，海南海口570228；2.海南大學材料與化工學院，海南?？?70228）

諾麗（Noni，Morinda citrifolia Linn），又稱海巴戟、海巴戟天，屬茜草科海巴戟天屬藥用植物，主要分布在南太平洋諸島嶼、澳大利亞、東南亞，以及我國的部分海域[1]。在波利尼西亞，諾麗作為傳統的保健食品和藥品已有2 000多年的歷史[2]。諾麗含有豐富的生物活性成分，包括多糖、生物堿、環烯醚萜、蒽醌、東莨菪素、糖苷類化合物、維生素和礦物質等[3-5]。現代研究顯示諾麗具有抗血栓、降血糖、抗菌活性，以及清除自由基，調節膽固醇，刺激免疫系統，調節細胞功能和凈化血液等多種功能，對癌癥、糖尿病、高血壓和痛風等多種疾病有較好的預防和治療作用[6-8]。1943年，美國將諾麗認定為可食用植物資源；2002年，歐盟認定諾麗果汁為一種新資源食品；2010年，中國衛生部批準諾麗果漿為新資源食品。目前投放市場的諾麗產品種類繁多，主要有諾麗發酵汁（諾麗酵素）、鮮榨汁、果粉以及果茶等，其中以諾麗發酵汁最為暢銷，保健功效性也宣稱最佳。當前國內外諸多諾麗加工企業對諾麗發酵汁的生產工藝以傳統自然發酵為主，將果裝入密封罐或桶中避光自然發酵（時間為二個月至一年不等），隨著發酵的進行，果汁從果肉中自然滲出，滲出的發酵汁顏色由淺褐色漸漸變深，最終呈深褐色，過濾后即得諾麗發酵汁[9]。由于諾麗發酵汁在生產過程中缺乏官方標準的質量控制程序和評價體系，所以通常區分高質量和低質量的諾麗發酵汁是困難的[10]。2007年，Potterat等[11]報道了可用于諾麗產品質量控制的定量高效液相色譜-質譜聯用（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS） 分析方法，確定了東莨菪素、環烯醚萜、蒽醌和3-甲基-1，3-丁二醇作為諾麗發酵汁的典型標記特征化合物。2011年，Basar和 Westendorf[12]確定了基于測定 2E，4Z，7Z-癸三烯酸（2E，4Z，7Z-decatrienoic acid，DTA），東莨菪素和鉀3種標記化合物的諾麗發酵汁質量評價的方法，使用此方法，可以簡單區分諾麗果汁有或沒有發酵步驟。

目前市場上諾麗發酵汁產地、品牌繁多，不同產地諾麗發酵汁的風味、顏色深淺各不相同。對其主要成分和活性物質的測定僅僅局限于單個地區，地區間的營養和活性成分的比較還鮮有報道。隨著諾麗發酵汁較高的營養、藥用和經濟價值逐漸被人們認識，需求量將逐漸增大。為此，本研究通過測定國內外6個不同產地諾麗發酵汁的主要營養成分和活性物質含量，并通過主成分分析對其進行評價，尋找諾麗發酵汁產地間的營養活性成分差別，了解不同地區、種植環境和生產技術等因素對諾麗發酵汁品質的影響，以期為諾麗發酵汁的質量分析、品質評價及其產品合理選擇提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

諾麗發酵汁均為商業市售，分別選自斐濟、新西蘭、泰國、大溪地、海南海口和海南萬寧6個原產地，樣品編號分別為：FJ、NZ、TL、DXD、HNH、HNW。

牛血清白蛋白標準品（純度＞98%）、考馬斯亮藍、福林酚：北京索萊寶科技有限公司；沒食子酸標準品（純度＞98%）、蘆丁標準品（純度＞98%）、東莨菪素標準品（純度＞98%）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2’-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2，2’-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate，ABTS）：美國 Sigma公司；去乙酰車業草苷酸標準品：武漢天植生物技術有限公司；其他化學試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

PB303-N電子精密天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；TU-1810紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；DK-98-1電熱恒溫水浴鍋：天津泰斯特儀器有限公司；TG16-WS高速離心機：長沙平凡儀器儀表有限公司；3B-5200-DTD超聲波清洗機：寧波新芝生物科技股份有限公司；Agilent1260高效液相色譜儀：美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 營養成分的測定

總酸含量測定：參照GB/T 12456-2008《食品中總酸的測定》，以乙酸計量；蛋白質含量測定：采用考馬斯亮藍方法[13]測定，通過牛血清白蛋白標準曲線回歸方程（y=0.020 7x+0.054 2，相關系數 R2=0.998 3）計算；還原糖含量測定：采用 3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）顯色法[14]測定，通過葡萄糖標準曲線回歸方程（y=0.993 2x-0.008 7，相關系數R2=0.999 7）計算；總酚含量的測定：采用福林酚（Folin-Ciocalteu，FC）比色法[15]測定，通過沒食子酸標準曲線回歸方程（y=0.103 7x+0.015 2，相關系數 R2=0.998 9）計算；總黃酮含量的測定：采用NaNO2-Al（NO3）3比色法[16]測定，通過蘆丁標準曲線回歸方程（y=0.007 1x-0.025 5，相關系數為R2=0.998 6）計算。

1.3.2 體外抗氧化活性的測定

DPPH·清除能力測定：參考MISHRA K等[17]的方法測定，以DPPH·清除率表示；ABTS+·清除能力測定：參考RE R等[18]的方法測定，以ABTS+·清除率表示；·OH清除能力測定：參考張偉敏等[19]的方法測定，以·OH自由基清除率表示；總還原力能力測定：參考OYAIZU M等[20]的方法測定，以吸光值表示。自由基清除率公式：

式中：Ai為待測夜在測定波長時的樣品吸光值；Aj為測定液在測定波長時的空白吸光值；Ac為未加測定液時模型的吸光值。

1.3.3 有機酸含量的測定

參照Sabokbar等[21]的方法稍作改進，采用液相色譜儀測定諾麗發酵汁中的有機酸含量。色譜條件：液相色譜儀：安捷倫1260，配有紫外檢測儀；色譜柱：安捷倫 Zorbax SB－aq（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.02 mol/L磷酸二氫鉀（pH=2.5）∶甲醇=98∶2（體積比）；柱溫 30 ℃；流速 0.5 mL/min；進樣量 10 μL；波長210 nm；等度洗脫40 min。

1.3.4 活性物質的測定

東莨菪素測定：參照謝婷[22]的方法稍加改進，采用安捷倫1260液相色譜儀進行測定。色譜條件：色譜柱：Zorbax SB－aq（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈 ∶乙酸水溶液（0.1%）=30∶70（體積比）；柱溫：35℃；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL；紫外檢測波長：346 nm；等度洗脫20 min。

去乙酰車葉草苷酸測定：參照陳建國等[23]的方法稍加改進，采用安捷倫1260液相色譜儀進行測定。色譜條件：色譜柱：Zorbax SB－aq（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：A：0.1%磷酸水溶液，B：乙腈；梯度洗脫：0～10 min 4%B；10 min～22 min 15%B；22 min～40 min 4%B。流速：0.5 mL/min；柱溫：35℃；紫外檢測波長：237nm；進樣量：10 μL；梯度洗脫 40 min。

1.3.5 統計分析

試驗數據均是3次重復試驗的平均值，結果表示為平均值±標準偏差（Mean±SD）。應用SPSS 24.0軟件進行Duncan’s組間差異顯著性統計和主成分分析（P＜0.05）。主成分分析（principal component analysis，PCA）時，以6個樣品中19個指標因子的定量結果組成6行19列矩陣，數據經標準化處理后進行分析，以累計貢獻率達95%以上來確定主成分的個數，同時將提取的主成分根據公式∑λiui（λ：主成分貢獻率，u：各樣品主成分值，i：1～4）計算各樣品的綜合得分。采用Origin 8.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 不同產地諾麗發酵汁營養成分分析

不同產地諾麗發酵汁的營養成分測定結果見表1。

表1 不同產地諾麗發酵汁營養成分含量Table 1 The contents of the nutritional ingredients in fermented noni juice from different regions

由表1可知，不同產地諾麗發酵汁中各項營養成分指標具有明顯的差異。不同產地諾麗發酵汁的總酸含量介于7.176g/L～13.728g/L之間，TL諾麗發酵汁的總酸含量（13.728 g/L）顯著高于其他產地（P＜0.05），最低為海南?？诋a地（HNH），其總酸含量為7.167g/L，總酸含量高于10 g/L的產地僅有TL和?？谌f寧產地（HNW）；不同產地諾麗發酵汁的蛋白質含量普遍較低，介于0.063mg/mL～0.230 mg/mL之間，斐濟產地（FJ）的蛋白質含量最高為0.230mg/mL，與新西蘭產地（NZ）和HNH沒有統計學上差異（P＞0.05），TL 的蛋白質含量最低，為 0.063 mg/mL；不同產地諾麗發酵汁中還原糖含量較為豐富，其含量在34.935mg/mL～89.979mg/mL之間，其中NZ的還原糖含量（89.979mg/mL）顯著高于其他產地（P＜0.05），是HNW發酵汁含量（34.935 mg/mL）的2.5倍之多；不同產地諾麗發酵汁中總酚和總黃酮含量差異顯著（P＜0.05），總酚含量介于0.790 mg/mL～1.262 mg/mL之間，總黃酮含量在0.377 mg/mL～0.833 mg/mL之間。其中NZ發酵汁的總酚和總黃酮含量最高，分別為1.262 mg/mL和0.833 mg/mL，顯著高于其他產地（P＜0.05），總酚含量最低為HNH發酵汁（0.790 mg/mL），總黃酮含量最低的為TL發酵汁（0.377 mg/mL）。李曉花等[24]對泰國、海南和西雙版納3個產地諾麗干果的主要營養成分、礦物質和氨基酸的含量進行了分析和比較，發現不同產地中營養成分含量差別較大，且不具規律性，從營養成分角度考慮，海南和西雙版納均適宜諾麗的種植。程池等[16]比較了我國西沙與大溪地產地的諾麗發酵汁總黃酮含量，發現西沙諾麗果汁中總黃酮含量范圍為0.250 mg/mL～0.301 mg/mL，平均含量為 0.274 mg/mL，與大溪地諾麗果汁無明顯差異（平均含量為0.223mg/mL）。說明可能由于不同產地土壤、氣候等生長條件有所差異，導致諾麗發酵汁營養成分差異性較大。

2.2 不同產地諾麗發酵汁抗氧化活性分析

不同的抗氧化化合物可能通過不同的作用機制與氧化劑發生反應，一個孤立的方法很難全面評估抗氧化劑的抗氧化能力，通常采用多種評價體系來衡量抗氧化特征[25－26]。因此，通過測定清除 DPPH·、ABTS+·、·OH能力和總還原力4種抗氧化活性體系來評價不同產地諾麗發酵汁的抗氧化能力，結果如表2所示。

表2 不同產地諾麗發酵汁的抗氧化活性Table 2 The antioxidant activity of fermented noni juice from different regions

由表2可知，不同產地諾麗發酵汁均顯示出不同程度的自由基清除能力和還原能力。不同產地諾麗發酵汁對不同自由基的清除能力和還原力上顯著差異（P＜0.05）。NZ和FJ在清除DPPH·能力上最強，清除率分別為67.536%、65.842%。而TL的DPPH·清除率最低（38.362%）。類似的，NZ在清除ABTS+·能力上依然保持較好的抗氧化性能，清除率高達77.594%，顯著高于其他產地樣品（P＜0.05）。各產地諾麗發酵汁對·OH清除能力與DPPH·清除能力相一致，清除率由大到小依次為：NZ（DPPH·：67.536%，·OH：51.534%）＞ FJ（DPPH·：65.854%，·OH：47.516%）＞DXD（DPPH·：57.894%，·OH：46.363%）＞ HNW（DPPH·：46.355%，·OH：44.642%）＞HNH （DPPH·：44.528%，·OH：40.989%）＞TL（DPPH·：38.362%，·OH：35.662%）?？傔€原能力的強弱以吸光度值的大小衡量，吸光度值越大表示還原能力越強。FJ和NZ產地的諾麗發酵汁總還原能力較強，吸光值為0.470和0.462，其次為HNH（0.376）和 DXD（0.356），HNW 和 TL 還原能力相對較弱（HNW：0.266，TL：0.254）。結果表明，諾麗發酵汁對各自由基具有較強的清除能力以及良好的還原能力。不同產地的諾麗發酵汁其抗氧化活性存在一定程度的差異。新西蘭（TL）和斐濟（FJ）的兩種產地諾麗發酵汁表現最好。

2.3 不同產地諾麗發酵汁有機酸含量分析

有機酸是發酵汁中主要的風味營養物質，其含量高低與發酵汁制品的品質有密切的關系。此外，發酵汁中的有機酸還可促進消化腺的活動，有助于食物的吸收，具有開胃和促進消化的作用[27]。通過高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）對不同產地諾麗發酵汁的8種有機酸含量測定，結果見表3。

由表3可知，8種有機酸在所有產地諾麗發酵汁樣品中均有檢出。各產地諾麗發酵汁中的有機酸含量存在一定的差異和相似性，各樣品有機酸總含量在22.238 mg/mL～35.286 mg/mL之間，其中TL發酵汁有機酸含量最高達到35.286 mg/mL，其次為NZ（27.660 mg/mL），HNH和HNW發酵汁有機酸總量相近，分別為30.357、29.664 mg/mL，FJ和DXD發酵汁含量較低，分別為23.058、22.238 mg/mL。在所有樣品中，8種有機酸在各產地的諾麗發酵汁中組成含量相似，均以半乳糖醛酸含量最高，其次為蘋果酸、乳酸、乙酸和琥珀酸，酒石酸和檸檬酸含量較低，而延胡索酸含量微乎其微。TL發酵汁半乳糖醛酸含量最高，占其有機酸酸總量的75.874%，其次為乙酸（6.029 mg/mL），占總量的17.286%；NZ發酵汁中半乳糖醛酸含量為13.473 mg/mL，占總量的48.709%，蘋果酸、乳酸和琥珀酸含量次之，分別占總量的18.232%、15.651%和12.343%。FJ發酵汁中半乳糖醛酸、蘋果酸和琥珀酸含量較高，分別占總量的45.693%、25.098%和18.150%。HNH和HNW中有機酸組成含量相似，半乳糖醛酸、乳酸和琥珀酸含量較高。DXD發酵汁中半乳糖醛酸、琥珀酸和乙酸較高，分別占總量的76.266%、12.303%和6.813%，乳酸含量相比其他產地含量較低。

表3 不同產地諾麗發酵汁有機酸含量Table 3 The contents of organic acid in fermented noni juice from different regions mg/mL

續表3 不同產地諾麗發酵汁有機酸含量Continue table 3 The contents of organic acid in fermented noni juice from different regions mg/mL

2.4 不同產地諾麗發酵汁活性物質分析

諾麗中富含多種生物活性化合物，東莨菪素和去乙酰車業草苷酸是諾麗中兩種主要的活性物質，具有抗腫瘤、抗氧化、抗畸變和降血脂等功能[28－29]。通過HPLC對不同產地諾麗發酵汁中兩種活性物質含量進行了測定，測定結果見圖1。

圖1 不同產地諾麗發酵汁中活性物質含量Fig.1 The contents of active substances in fermented noni juice from different regions

由圖1可知，各樣品中去乙酰車業草苷酸含量高于東莨菪素，不同產地發酵汁中東莨菪素和去乙酰車業草苷酸含量差異顯著（P＜0.05）。NZ發酵汁中東莨菪素含量最高，達到76.873 μg/mL，顯著高于其他產地（P＜0.05），其次為 FJ（56.468 μg/mL）、HNH（28.451 μg/mL）、HNW（27.239 μg/mL）和 TL（13.097 μg/mL），DXD 含量最低（11.203 μg/mL）；FJ發酵汁中去乙酰車業草苷酸含量最高，達到1.235 mg/mL，顯著高于其他產地（P＜0.05），其次為 NZ（1.167 mg/mL），HNH（0.785 mg/mL）、HNW（0.592 mg/mL）和 DXD（0.325 mg/mL），TL 含量最低（0.121 mg/mL）?？傮w上，在兩種活性成分方面，NZ和FJ產地均優于其他4種產地，其次為HNH和HNW，而DXD和TL差之。Potterat等[11]采用薄層色譜法（thin layer chromatography，TLC）標記鑒定及 HPLCMS定量分析比較不同產地8種商業諾麗發酵汁中東莨菪素和去乙酰車業草苷酸含量，發現東莨菪素含量在未檢出到0.023 mg/mL之間，去乙酰車業草苷酸在0.23 mg/mL～2.42 mg/mL之間，其斐濟產地兩者含量均高于大溪地和泰國產地，這與我們結論相一致。

2.5 不同產地諾麗發酵汁各指標的主成分分析

諾麗發酵汁品質的構成因子較多，不同品質因子之間存在著密切相關性和相對獨立性。為綜合評價不同產地諾麗發酵汁的營養成分和活性物質差異，對已測定的營養成分、抗氧化活性、有機酸和活性物質共19個因子在構建6行×19列矩陣的基礎上進行主成分分析（principal component analysis，PCA），將各指標因子進行無量綱標準化處理后，求得的相關系數矩陣，根據累計方差貢獻率大于95%的原則提取了4個主成分。其中不同產地諾麗發酵汁的主成分1與主成分2因子載荷圖如圖2所示。由圖2可知，第一主成分的貢獻率為39.116%，而第二主成分的貢獻率為23.285%，兩者總和貢獻率為62.401%，表明前兩主成分并未能完全體現諾麗發酵汁中全部信息，而提取的前四個主成分的詳細載荷矩陣如表4所示。

圖2 不同產地諾麗發酵汁的主成分1（PC1）與主成分2（PC2）因子載荷圖Fig.2 Graphical representation of the principal component analysis of fermented noni juice from different regions showing PC1 vs PC2：factor loading

表4 主成分因子載荷矩陣Table 4 Component load matrix after principal component analysis

由表4可知，前4個主成分的特征值分別為7.432、4.424、3.775和3.062，累積方差貢獻率達98.386%，說明前4個主成分基本能夠客觀反映諾麗發酵汁各指標信息。決定第1主成分（PC1）大小的主要是總酸、蛋白質和乙酸；決定第2主成分（PC2）大小的主要是總酚、·OH和DPPH自由基清除率；決定第3主成分（PC3）大小的主要是去乙酰車業草苷酸、東莨菪素和蘋果酸；決定第4主成分（PC4）大小的主要是乳酸和還原糖。

2.6 不同產地諾麗發酵汁品質綜合評價

通過累計方差貢獻率提取的4個主成分為綜合評價的指標，計算得到不同產地諾麗發酵汁的主成分得分及綜合得分見表5。

表5 不同產地諾麗發酵汁的主成分得分及綜合排序Table 5 Factor scores and comprehensive ranking of fermented noni juice from different regions

由表5可知，FJ和NZ諾麗發酵汁分別排第一和第二，其次為HNH、DXD和HNW，TL綜合得分最低。

在目前諾麗發酵汁營養成分和活性物質的評價方法和指標體系尚沒有確定的背景下，借鑒其他食品種類[30-32]的數學分析方法，主成分分析為評價諾麗發酵汁營養質量指標提供一定的技術分析支撐，以期對只依據部分活性物質來評價諾麗發酵汁品質的方法提供了一條新的思路。

3 結論

本研究對國內外6個不同產地的諾麗發酵汁的營養成分和活性物質進行分析與評價。結果表明，諾麗發酵汁的營養成分、抗氧化活性、有機酸和活性物質等指標均呈現明顯的產地差異性。在營養成分方面，TL總酸含量顯著高于與其他產地。NZ還原糖、總酚和總黃酮含量均高于其他產地。在抗氧化活性方面，NZ的自由基清除能力均優于其他產地，FJ在還原能力上表現最好。6個產地的諾麗發酵汁均檢出8種有機酸且各有機酸含量差異明顯。各產地諾麗發酵汁有機酸組成中均以半乳糖醛酸含量最高，延胡索酸含量最低，在總量上，以TL為最高，這與總酸含量相吻合。在活性物質方面，NZ和FJ的東莨菪素和去乙酰車業草苷酸含量均高于其他4種產地。通過主成分分析發現，FJ綜合品質評價評分最高，其次為NZ，表明其綜合營養品質較為優良，而TL得分較低。