毒死蜱對斑馬魚的急性毒性試驗

霍奕安，胡秀彩，呂愛軍，孫敬鋒

（1.天津農學院水產學院，天津市水產生態及養殖重點試驗室，天津300384；2.天津農學院，創新創業試驗室，天津300384）

斑馬魚（Danio rerio）又名藍條魚、花條魚、斑馬擔尼魚等，是一種熱帶觀賞魚體長4～6 cm，胚胎透明且體外發育，易于活體觀察，生長發育快[1]。因此已經成為生命科學中對疾病，遺傳和毒理學的理想模式生物[2]。隨著人類社會的迅速發展，工業上產生的各種廢棄物，如重金屬，工業污水，農業上產生的農藥、消毒液殘留等有害物質通過雨水沖刷，或者直接向農田施肥等途徑對土壤、魚類等產生了嚴重的影響，并且直接威脅到人類健康。目前，國內關于魚類急性毒性的試驗研究，經常以鯉、金魚作為試驗對象，斑馬魚還未被廣泛地應用于藥物毒理學的研究[1-2]。近幾年，斑馬魚可作為監測藥物靶器官的有效模型，而毒死蜱對于水生生物的急性毒性研究相對較少[3-6]。我國目前農藥年產量已達到80萬t，居于世界第2位[7-9]。毒死蜱是一種廣譜高效的有機磷殺蟲、殺螨劑，具有觸殺、胃毒和熏蒸作用，對魚類和水生生物毒性較高毒[10-11]。該試驗采用農藥毒死蜱對斑馬魚進行急性毒性試驗，獲得了毒死蜱對斑馬魚的基礎毒理學數據，為水產養殖和魚病防治等提供了數據參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

斑馬魚購于天津市某花鳥市場，平均體長3.9 cm，平均體質量0.44 g。毒死蜱（有效成分含量40%，規格300 g，乳油劑型），購自湖北仙隆化工股份有限公司。

1.2 試驗方法

參照呂愛軍等[12]試驗方法進行，采用靜水法進行急性毒性試驗。斑馬魚試驗前在室內馴養5 d以上，其自然病死率小于1%，試驗前1 d停止投喂飼料，在試驗期間不喂食。培養箱溫度為（25±2）℃，光照/黑暗為12 h/12 h。以毒死蜱配制7個不同濃度系列，并設1個空白對照，每個濃度及對照組隨機放入10尾斑馬魚。試驗開始后連續觀察8 h，并觀察和記錄魚的中毒情況（呼吸、反應、平衡、游動、體色變化）及96 h內的死亡情況和開始死亡時間與死亡數目。當出現魚死亡時，及時撈出，以免污染水質，觀察記錄魚體表特征與內臟表面特征。試驗時間是96 h，96 h后如果仍有活魚，則繼續試驗至7 d。

1.3 數據處理

試驗數據分析采用的是Bliss法來計算斑馬魚的半致死濃度LC50，安全質量濃度用公式為

病死率=死亡試驗魚數/試驗魚總數×100%。

2 結果

2.1 斑馬魚急性毒性試驗結果

毒死蜱對斑馬魚急性毒性試驗發現，毒死蜱質量濃度為1.3 mg/L時，5 h后有1條開始出現失衡，偶爾急速竄游現象，12 h內試驗魚出現死亡，死亡1條，鰓部有明顯出血現象，至24 h病死率為20%，到48 h已經死亡70%，24～48 h是斑馬魚的集中死亡時段；毒死蜱質量濃度達到1.4 mg/L時，72 h內斑馬魚病死率達到100%；毒死蜱質量濃度為1.5 mg/L時，7 h內試驗魚身體出現明顯折彎現象，鰓部均有不同程度的出血，至12 h死亡6條，至48 h全部死亡。毒死蜱質量濃度低于1.0 mg/L時，1周后仍有試驗魚存活。各組的試驗魚7 d時的病死率相比于96 h，在質量濃度為0.9 mg/L和質量濃度為1.0 mg/L時出現變化，分別病死率從50%上升至80%、60%上升至90%。當毒死蜱質量濃度為0.6 mg/L時，未出現試驗魚死亡，說明此時毒死蜱對斑馬魚的毒性作用比較小（表1）。

表1 毒死蜱對斑馬魚急性毒性作用（病死率） %

2.2 斑馬魚中毒表現及死亡特征

毒死蜱對斑馬魚中毒較快，反應比較強烈。在低濃度梯度試驗中，斑馬魚剛開始放入時，一般都出現較為激烈的急速躥游現象，但隨后會消失，消失的時間長短與濃度有關。適應試驗環境后，魚群積極游動，偶爾會有集群現象，既而出現上浮、頂水、尾略下垂等現象。但是隨著中毒程度的愈來愈深，試驗魚出現抽筋，時而翻肚、時而垂直于水面等失衡現象，或者沉于水底，并且呼吸加快加重或弓背，身體出現明顯折彎現象，漸漸地游動能力減弱甚至喪失、反應遲鈍、沉于水底，幾乎都會出現腮部出血直至死亡。

在高濃度梯度試驗中，斑馬魚在開始受藥的短短2～5 h中，出現強烈的急速竄游，嚴重失衡掙扎現象，甚至躍出水面。試驗魚短時間內鰓部出現明顯出血，繼而在水中打轉，直至死亡，身體有很明顯的折彎現象。高質量濃度組相比于低質量濃度組從斑馬魚受試中毒到死亡的間隔時間變短，中毒現象也更加明顯。

2.3 LC50值及質量安全濃度（SC）

經過統計學分析，計算毒死蜱半致死濃度和質量安全濃度值見表2。試驗結果表明，毒死蜱的安全質量濃度為0.209 mg/L。參照GB/T 21281—2007我國化學物質對魚類毒性分級標準（96 h LC50≤1.0 mg/L時為急性毒性Ⅰ級，1.0 mg/L≤96 h LC50≤10.0 mg/L為急性毒性Ⅱ級，10.0 mg/L≤96 h LC50≤100.0 mg/L為急性毒性Ⅲ級）[13]。毒死蜱的96 h LC50為0.926 mg/L，由此判定毒死蜱對斑馬魚的急性毒性為Ⅰ級。根據《化學農藥環境安全評價試驗準則》[14]中農藥對魚類的毒性等級劃分（劇毒，96 h LC50≤0.1 mg/L；高毒，96 h LC50≤1.0 mg/L；中毒，1.0 mg/L＜96 h LC50≤10.0mg/L；低毒，96 h LC50＞10.0 mg/L），可判定敵敵畏對斑馬魚為高毒。

表2 斑馬魚的LC50和SC

3 討論

近幾年，斑馬魚可作為監測藥物靶器官的有效動物模型，而毒死蜱對于水生生物的急性毒性研究相對較少[3-6]。趙于丁等[15]報道10種農藥對斑馬魚的毒性與安全評價中，涉及到毒死蜱對于斑馬魚的毒性研究，結果顯示毒死蜱對于斑馬魚的24、48、72和96 h的半致死濃度分別為0.7943、0.7332、0.6434和0.5184 mg/L，并且斑馬魚對于毒死蜱的中毒癥狀為先興奮，后游動遲緩或困難，得出的結果判定毒死蜱對斑馬魚為高毒。在該試驗中，毒死蜱對斑馬魚的安全質量濃度為0.209 mg/L，斑馬魚24、48、72和96 h的半致死濃度較高，這可能與斑馬魚品系、季節和氣溫等有關。斑馬魚對于毒死蜱的中毒癥狀相對一致，而且判定毒死蜱對斑馬魚均為高毒，可以為水產養殖和魚病防治提供相對有價值的參考數據。

馬軍國等[16]通過毒死蜱對于尖膀胱螺的急性毒性試驗發現，毒死蜱對尖膀胱螺24、48、72和96 h時的半致死濃度分別是0.577 mg/L、0.308 mg/L、0.243 mg/L和0.160 mg/L以及安全質量濃度為0.016 mg/L，顯示毒死蜱對于螺類的毒性要大于斑馬魚。馬繼華等[17]報道毒死蜱對于南美白對蝦的急性毒性影響，結果表明對南美白對蝦24、48、72和96 h 的半致死濃度分別為 3.44 μg/L、2.08 μg/L、1.36 μg/L和0.89 μg/L以及安全質量濃度為0.0089 μg/L，可見毒死蜱對于蝦類的毒性更加高。已有報道南美白對蝦表現出來的中毒癥狀有狂游和沖撞，在水中打轉；或者上下直竄，急速游動。持續一段時間之后，體色開始變白變淡，逐漸喪失游泳功能，失去平衡，躺臥在水底。南美白對蝦在高濃度梯度試驗組中的中毒反應很迅速，在短時間內全部個體都出現明顯的中毒癥狀；而在低濃度試驗組中，則要經過很長時間之后才有個別受試蝦出現異常的癥狀。這與毒死蜱對于斑馬魚的中毒現象非常相似，尤其體現在魚體色變淡，出現急速竄游和失衡等現象。

該研究結果表明，毒死蜱對斑馬魚的急性毒性為Ⅰ級，對斑馬魚的毒性等級為高毒。毒死蜱的安全質量濃度為0.209 mg/L，因而毒死蜱對于斑馬魚的毒性較為強烈，不是斑馬魚的安全藥物，不建議用來作為殺滅寄生蟲漁藥，在水產養殖中需要謹慎使用。