影響斑點叉尾 病毒病發(fā)病因素的探索

劉洪巖，王江，張世勇，王明華，趙彥華，陳校輝，邊文冀

（江蘇省淡水水產研究所，江蘇 南京 210017）

斑點叉尾 病毒（Channel catfish virus,CCV），屬于皰疹病毒科（Herpesvirus）， 魚皰疹病毒屬（Ictalurivirus）[1]。CCV 是一種線性雙鏈 DNA 病毒[2]，病毒顆粒為20面體對稱，核衣殼由162個殼粒組成，直徑約為100nm，具有囊膜的完整病毒粒子，直徑約為175～200 nm[3]。CCV基因組全長為134.2 Kb，共有79個開放閱讀框。CCV通過滾環(huán)方式復制，可發(fā)生在10-35℃溫度范圍內，35℃時復制速度最快，而30℃時復制量最大，最適的復制溫度是25-33℃。CCV能夠在25℃的池水中生存2 d，在池底淤泥中迅速失活[4]。

斑點叉尾 病毒傳播速度快、病程短、病死率高，給斑點叉尾 產業(yè)帶來了嚴重的經(jīng)濟損失。在已知的報道中發(fā)現(xiàn)，CCV的產生和傳播和外部環(huán)境有很大的關系，但并沒有確定各種影響因子對發(fā)病的具體影響力。因此，在目前的預防和治療措施中，沒有提出有效的解決預防方案，只能通過有效的管理來將影響降低。該試驗通過對斑點叉尾 攻毒CCV，觀察不同的溫度、病毒量以及種質對發(fā)病以及病死率的影響，旨在為CCVD的防控和斑點叉尾 抗病品種的選育提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

2017年12月從江蘇省淡水水產研究所揚中基地6—7月繁育的49個斑點叉尾 家系中隨機挑選體質量為15.0～20.0 g的健康幼魚于江蘇省淡水水產研究所實驗室內進行暫養(yǎng)2周。暫養(yǎng)期間每天投喂兩次，使用嘉吉精養(yǎng)魚料進行投喂，正式試驗開始后停止喂食。使用加熱棒將水溫控制在28～30℃。

1.2 試驗藥物

試驗用的CCV來自于華中農業(yè)大學，試驗病毒先配置母液，梯度稀釋為103，104，105 TCID50。

1.3 試驗方法

試驗全程在室內進行，使用容量為250 L的塑料箱進行養(yǎng)殖，試驗用水為經(jīng)過曝氣處理的自來水，pH 值7.8～8.2，溶解氧濃度＞5 mg/L，光照 200～1 200 lx，24 h曝氣。選擇100 g左右，大小均勻的斑點叉尾 進行試驗，每組10條。采用腹腔注射的方式進行攻毒，注射病毒體積為100 μL。

病毒濃度影響實驗中，設103 TCLD、104 TCLD、105 TCLD 3個濃度組，每組3個平行。溫度影響試驗中設置兩個溫度，分別為10℃和18℃，每個組設置3個平行實驗。種質影響試驗中，設置兩種種質，分別為正常的斑點叉尾 和白化的斑點叉尾，每個組設置3個平行試驗。溫度影響試驗中，試驗組攻毒的濃度為104 TCLD；種質影響試驗中，試驗組攻毒的濃度為103 TCLD。對照組同樣設置3個平行，注射等量體積的生理鹽水。

病毒注射后便開始正式試驗，及時觀察魚體活動情況，并記錄死亡情況及時撈出死亡個體。死亡標準為觸碰無任何反應。

1.4 計算公式

試驗結束后按以下公式計算：

累積病死率（cumulative mortality,CM）=（累計死亡魚尾數(shù)/攻毒魚尾數(shù)）×100%

2 結果

斑點叉尾 注射CCV后，觀察發(fā)現(xiàn)大部分魚體均出現(xiàn)不同程度的感染現(xiàn)象，前期主要出現(xiàn)魚集群聚集在角落，部分魚在水中急促緊張游動，出現(xiàn)打轉、翻轉現(xiàn)象，最后倒立在水中死亡。體表發(fā)現(xiàn)鰭條基部、尾柄、肌肉有出血點，腹腔膨大，單側或雙側眼球凸出，腮絲發(fā)白，表皮發(fā)黑。解剖后腹腔內有黃褐色積水，腸道呈現(xiàn)灰白色，肝、脾腫大且有出血點，腎也發(fā)現(xiàn)有出血。

2.1 溫度對CCVD暴發(fā)的影響

斑點叉尾 在注射CCV之后，由于魚體自身免疫和病毒劑量的關系48 h內沒有出現(xiàn)死亡。高溫度組（18℃）第3天開始開始出現(xiàn)死亡，低溫度組（10攝氏度）第5天出現(xiàn)死亡。高溫度組的LC 50出現(xiàn)在第12天，低溫度組LC50出現(xiàn)在第13天，在第13天之后，高溫度組和低溫度組沒有明顯差異，高溫度組在17 d全部死亡，低溫度組在18 d全部死亡。至試驗結束，對照組全部存活。試驗結果如圖1所示。

圖1 不同溫度組斑點叉尾累積病死率和累計病死數(shù)目

2.2 病毒濃度對CCVD暴發(fā)的影響

斑點叉尾 在注射CCV 20 h之后，105TCLD出現(xiàn)死亡，104TCLD組在攻毒后3 d出現(xiàn)死亡，103TCLD組在第8天才出現(xiàn)死亡。103組第八天開始出現(xiàn)了暴發(fā)性死亡，從開始死亡到全部死亡，用時10 d，與104TCLD和105TCLD接近。103TCLD，104TCLD，105TCLD組的LC50分別出現(xiàn)在第13天，第12天和第10天。試驗結果如圖2所示。

2.3 種質濃度對CCVD暴發(fā)的影響

為了突出種質的區(qū)別，試驗中選取了正常的斑點叉尾 和白化斑點叉尾 作了對比試驗。白化組在第3天開始出現(xiàn)暴發(fā)性死亡，病程短，從出現(xiàn)死亡到全部死亡用時4 d，正常組在第8天開始出現(xiàn)死亡，病程較長，全部死亡用時10 d。103TCLD攻毒時，正常組的LC50出現(xiàn)在第10天，白化組的LC50出現(xiàn)在第5天。實驗結果如圖3所示。

3 討論

該試驗討論了溫度，病毒濃度和種質對CCVD暴發(fā)的影響。

圖3 不同種質組斑點叉尾累積病死率和累計病死數(shù)目

在溫度的試驗中，10℃組和18℃組在暴發(fā)的時間上時有區(qū)別的，低溫組暴發(fā)遲緩。兩組實驗中，從暴發(fā)到死亡所用的時間，也就是病程，并無很大區(qū)別，低溫組用時13 d，高溫組用時15 d。這說明，溫度會影響病毒的復制，溫度升高會加快病毒的復制，但是，當病毒達到一定的濃度時，溫度這一因子對疾病的暴發(fā)影響力并不大。與以往的研究不同，該次試驗中，在10℃的試驗組發(fā)現(xiàn)了CCVD的暴發(fā)，這說明在低于15℃時，CCVD是可能暴發(fā)的。

在觀察濃度對CCVD的暴發(fā)的影響時，發(fā)現(xiàn)，低濃度組（103）暴發(fā)最晚；高濃度組（105）最先暴發(fā)。這證明，病毒在魚體內達到一定的量，才會對魚造成傷害，CCVD暴發(fā)的時候，魚體內的病毒已經(jīng)達到了一定濃度。高濃度的病毒作用下的是急性病毒病感染，個體免疫系統(tǒng)不能迅速地將所有的病毒清除，因此，短時間內會出現(xiàn)較多的死亡，但是，由于個體差異，有些個體免疫反應比較強，對病毒清除比較快，因此不會在短時間內一下都發(fā)病[5]。低濃度的病毒感染是慢性感染，病毒感染后，宿主有時間修復病毒造成的組織損傷，因此CCVD暴發(fā)需要長時間的病毒復制才能實現(xiàn)，所以出現(xiàn)了暴發(fā)推遲，但是暴發(fā)的病程并沒有延長，這是因為病毒在宿主體內存在并不斷復制，發(fā)病時已經(jīng)達到了高濃度，并且由于慢性的病毒感染，已經(jīng)導致了部分器官的病變，因此病程不會延長。

種質對CCVD暴發(fā)影響的試驗證明，種質在對抗疾病中起到關鍵性作用。試驗中使用了白化的斑點叉尾 ，在低濃度作用下，會迅速暴發(fā)引起死亡（第3天暴發(fā)VS正常組第8天暴發(fā)），病程極短（白化組病程4 dVS正常組病程10 d）。這說明，種質對CCVD暴發(fā)有很大的影響。種質的差異，區(qū)別于個體的差異，是一種群體的表現(xiàn)，白化群體表現(xiàn)出來對CCVD抗性非常弱。這也說明了選育抗病品質的必要性和可行性。

綜合目前國內外的相關研究可以發(fā)現(xiàn)，CCV是一種傳播速度極快、危害十分嚴重的急性傳染病。感染后的致死率甚至能夠超過90%達到100%。大規(guī)模的暴發(fā)CCV將會給養(yǎng)殖產業(yè)帶來極其嚴重的經(jīng)濟損失。目前常用的CCV檢測手段主要是通過細胞培養(yǎng)的方式分離病毒，然后使用免疫熒光或PCR分子鑒定的方法來進行檢測，但操作步驟過于繁瑣且周期較長[6-7]。李惠芳等人建立的實時熒光定量PCR檢測方法則大大提高的檢測速率和準確性[8]。

在目前的技術條件下還沒有有效的治療方法來控制CCV，只能通過合理高效的管理手段來降低發(fā)病風險。從而將損失壓到最低。

首先要定期對養(yǎng)殖場環(huán)境進行檢疫，尤其是苗種的產地檢疫。由于CCV是可以垂直傳播的，并且在病毒積累到一定量才會發(fā)病，因此，攜帶者就是暴發(fā)的危險因子。一旦發(fā)現(xiàn)有攜帶CCV，應該及時清除。其次，消毒，減少環(huán)境對魚的應激，苗種孵化一定要采取消毒措施，對于已經(jīng)感染病毒的苗種要及時清除，使用的工具也要進行銷毀。最后是新品種的培育。種質在抗病中起到關鍵作用，不同的種質對于疾病的敏感性不同，例如抗病基因的篩選（干擾素高表達品種），抗病SNP篩選等等[9]。因此，選育抗病新品種是預防CCVD暴發(fā)的關鍵[10]。