FMR1基因CGG重復序列頻度與反復生育失敗或卵巢早衰婦女的相關性研究

陳蔚琳，金力*，武淑英，張軍，臘曉琳，米鑫，童英，楊悅

(1.中國醫學科學院 北京協和醫學院 北京協和醫院婦產科，北京 100730；2.北京大學第三醫院，北京 100191；3.首都醫科大學附屬北京安貞醫院，北京 100029；4.新疆醫科大學第一附屬醫院，烏魯木齊 830054；5.北京兒童醫院順義婦兒醫院，北京 101300；6.空軍總醫院，北京 100142；7.民航總醫院，北京 100123)

脆性X智力低下1號基因(Fragile X Mental Retardation 1，FMR1)位于性染色體X的末端Xq23.7，其啟動子區存在著以CGG為單位的動態三聯重復。根據不同的擴增概率，美國醫學遺傳學和基因組學學會(American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)將CGG重復序列分為四大類[1]：CGG重復數在5～44之間定義為“正常型”；45～54之為“中間型”或者“灰區”；55～199之間為“前突變”(premutation，PM)；200以上為“全突變”(full mutation，FM)。全突變的臨床表型即為脆性X綜合征(Fragile-X Syndrome，FXS)，在臨床上有典型的遺傳性智力低下或自閉癥等表現，常見于男性。女性因為有兩條X染色體，所以常表現為一條X染色體的隨機失活，故智力低下表型較少，但可遺傳至子代。女性PM攜帶者也可以在遺傳至子代時發生全突變，分娩FXS兒，而自身表型正常。此外由于CGG重復序列翻譯所形成的物質可能以某種方式干擾了胎兒卵巢FMR1基因的轉錄，引起該突變基因的攜帶者在出生時即存在卵母細胞數量和質量的下降，其卵巢功能的臨床表型具有高度的異質性[2]，可發生脆性X相關的卵巢儲備能力下降(Fragile X Associated Diminished ovarian reserve，FXDOR)，表現為不明原因不孕癥或生育力下降，如反復不明原因流產或IVF失敗等。也可能表現為脆性X相關的原發性卵巢早衰(Fragile X Associated Premature Ovarian Insufficiency，FXPOI)[3]，即出現小于40歲的閉經。所以目前認為FMR1是導致卵巢儲備功能下降甚至卵巢早衰的重要突變基因之一。灰區主要指那些在遺傳中基因表達的CGG重復缺乏穩定性的類型，而關于灰區的臨床意義目前的數據缺乏統一性，有研究發現“灰區”與正常核型的患者比較，前者的預期絕經年齡早(約7年)，不孕癥及月經周期異常的發生率高，卵巢早衰發生率高，而且非整倍體妊娠流產的發生率高[4]。但也有研究認為它并不能用來預測卵巢儲備功能[5-6]。

我國大陸關于FMR1基因的研究起于1986年的家系報道[7]，之后由于篩查手段的限制一直沒有開展大規模的篩查研究。2015年Huang等[8]報道了我國的第一個較大人群的FMR1基因篩查結果，1 113例漢族人群(534男性和579女性)中有1例女性PM攜帶者。2014年我國學者也針對卵巢功能低下女性進行了FMR1基因的分布研究，但因為樣本量較小，僅在117名卵巢功能低下的女性中，發現了一名患有不孕癥的FMR1基因PM攜帶者，未發現“灰區”[9]。以上為數不多的來自中國的報道提示，FMR1基因的中國人群的篩查資料目前仍是空白，而關于其在卵巢功能低下女性的分布更是貧乏。因此本次研究通過FMR1基因CGG重復序列的檢測，對首次從基因水平探究中國大陸反復生育失敗婦女和卵巢功能異常的原因具有非常重要意義，在此特殊人群中進行的一次較大樣本量的篩查，為進一步獲得FMR1基因在我國的正常人群的分布數據，提供先期研究數據和研究路徑。

資料與材料

一、研究人群

2016年8月至2017年12月開展了全國多中心的橫斷面研究，入選人員為18～45歲的育齡婦女。

入選者根據異常生育史和卵巢功能分為3組，分別為：A.不明原因反復生育失敗婦女，包括反復妊娠失敗或IVF反復失敗者(2次以上)，不孕癥；B.卵巢早衰患者(40歲之前絕經)，除外手術或藥物性原因；C.家族中有自閉癥、不明原因智力低下兒出生史的婦女。

本研究通過北京協和醫院醫學倫理委員會同意(倫理證書編號HS-856)；入選患者均簽署知情同意書。

二、試驗方法

DNA提取：每位受試者采取2 ml靜脈全血，外地單位凍存統一快遞，北京市單位當日快遞送至北京大學第一醫院檢驗科進行DNA提取，使用QIAamp全血DNA提取試劑盒(Qiagen，德國)，實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

CGG重復數的測定：使用AmplideX試劑盒(Asuragen，美國)，采用熒光PCR技術，并用毛細管電泳儀進行擴增產物的分析。PCR體系包含11.45 μl的高GC擴增緩沖液、1.5 μl的FAMM標記FMR1引物(包含F引物、R引物和CGG第三引物，其中R引物是唯一的熒光標記引物，引物序列見表1)、0.05 μl的高GC聚合酶溶液。PCR體系在分裝進96孔PCR板之前進行混勻和離心。每個PCR孔加入20 ng/μl的DNA模板2 μl，用膜封裝后混勻并離心。將PCR板放入ABI 7500擴增儀進行擴增。樣本擴增條件：98℃熱變性5 min；25個循環(97℃ 35 s，62℃ 35 s，72℃ 4 min)；72℃最后延伸 10 min。PCR結束后，產物在進行瓊脂糖凝膠電泳或毛細管電泳前避光保存于-15℃到-30℃之間。擴增產物分析采用ABI的3730XL毛細管電泳儀和Genemapper4.0分析軟件(3730XL Genetic Analyzers，Life Technology，日本)。

表1 FMR1引物序列

三、統計方法

所有統計數據均應用SPSS 17.0進行處理。在同一個體中FMR1的兩個等位基因(CGG)重復次數相對少者定義為allele-1，相對多者定義為allele-2。按照國際慣例[5]，本研究取allele-2的重復數進行統計分析。

結 果

一、CGG重復序列分布情況

本研究共入組2 334例反復生育失敗及卵巢功能異常婦女。其中，A組2 216例，年齡(31.17±4.76)歲(18～47歲)；B組70例，年齡(31.54±6.60)歲(18～46歲)；C組48例，年齡(33.70±4.72)歲(25～45歲)。

共發現39種不同的CGG重復數，最小20，最大200。最常見的CGG重復次數是30(718例，占33.8%)和29(669例，占28.7%)，占總的等位基因中62.5%；第三個常見的CGG重復次數是36(357例，占15.3%)。CGG重復次數<29者共88例(3.94%)，而>36者共130例(5.82%)。具體CGG重復序列分布見圖1。

圖1 CGG重復序列分布情況

二、研究人群前突變(PM)及灰區分布情況

總受檢人群中共發現16例PM和15例灰區，未發現全突變(FM)。PM在總人群的發生率為1∶146，其中A組6例(發生率1∶369)、B組2例(發生率1∶35)、C組8例(發生率1∶6)；研究中灰區的患者均在A組，組內發生率為1∶148。本研究中不同組的PM及灰區分布見表2。各組PM患者的CGG重復數見表3，重復數>100的兩例均分布在C組。

表2 研究人群的前突變及灰區分布情況[n(‰)]

表3 研究人群前突變核型的CGG重復數

三、FMR1基因型分析

根據兩個等位基因(CGG)重復次數的不同，FMR1基因分為3種基因型：兩個等位基因重復次數均在正常范圍內稱為“野生型”；其中一等位基因在正常范圍內，而另一個等位基因重復次數超出正常范圍的稱為“突變雜合型”(簡稱雜合型)；兩個等位基因均超出正常者稱為“突變純合型”(簡稱純合型)。本研究組的FMR1基因異常均為突變雜合型，無純合型。

討 論

一、FMR1基因在卵巢儲備功能中的分子學機制

卵巢儲備功能直接關系到婦女生育能力和妊娠結局，它是卵巢皮質內原始卵泡發育成可受精卵母細胞的能力。卵巢儲備能力下降是指卵巢內存留的卵泡的質量和數量下降。FMR1基因是導致卵巢儲備能力下降的重要基因，而目前關于CGG重復序列擴增對于FMR1基因表達的調控機制，以及如何影響到卵巢功能的分子機制目前尚不清楚。當CGG重復序列小于45時，FMR相關蛋白和FMR mRNA的功能穩定。而在PM和“灰區”攜帶者中，由于翻譯的錯誤而導致兩者的不匹配，FMR1相關蛋白水平下降而FMR1mRNA水平上升，從而發生細胞毒性作用，致使出生前卵泡池的卵泡數量下降。而出生后mRNA誘導的卵巢的顆粒細胞毒性及間質細胞中FMR多糖甘氨酸[10]的作用，使得卵泡的成熟障礙，凋亡加速，推測可能是女性胚胎期和生后兩個時期的疊加作用，而導致FXDOR和FXPOI的發生[11]。不過在卵巢早衰的動物模型中發現PM對始基卵泡沒有作用，而是作用于后期卵泡的成熟和凋亡[12]。所以FMR1基因可能繼FSH、抑制素B及抗苗勒管激素之后，成為預測卵巢儲備功能的指標。

二、FMR1基因CGG重復數在不明原因反復生育失敗或卵巢早衰人群分布

不明原因反復生育失敗是卵巢儲備功能低下的一種表型，故本研究A組和B組涉及的人群均為卵巢功能異常人群。在該人群中最常見的CGG重復次數是30(33.8%)和29(28.7%)，占總的等位基因的62.5%；第三個常見的CGG重復次數是36(15.3%)。所以最終表現為CGG重復數的“雙峰現象”。我們的結果與亞洲人種的CGG分布狀況基本相似[13-14]。環比大多數針對西方人群的研究均顯示“單峰”聚集，30和29是最常見的CGG重復數[15-16]。而亞洲人種還有34-36的集中趨勢亞峰，而非29-30次單峰。此外CGG重復數<29和≥36的比例在亞洲人種中也顯著偏低[17]。

三、FMR1前突變和灰區在不明原因反復生育失敗或卵巢早衰人群分布情況

本研究在總受檢人群中共發現16例PM和15例灰區，未發現FM，因此，在該人群中PM的發生率為1∶146。2014年的系統回顧[18]中PM在女性的發生率為1∶150～300，男性發生率為1∶400～850。FMR1基因PM發生率在不同種族和地域差異較大。但是如果按照人種區分，高加索人群中表現了較高的PM發生率，比如西班牙1∶251[19]、法國1∶246[20]、美國1∶382[21]、伊朗1∶113[22]；而目前發現東亞人種的PM發生率明顯低于以上數據，如中國臺灣15年3 911例低危人群的PM發生率為1∶1 955[23],韓國5 800例女性篩查結果為1∶781[24]，而在日本的946例篩查中竟沒有發現一例PM攜帶者[25]；而在中國大陸漢族人群(2 000例)的篩查中PM的發生率也與其他東亞人群類似，僅為1∶1 113[8]～1∶1 325[26]。相比之下，本研究在不明原因反復生育失敗或卵巢早衰的人群中篩查，發生率明顯高于正常人群的篩查，凸顯FMR1基因在該組人群中篩查意義的深遠。

本研究PM發生率最高的是家族中有自閉癥、不明原因智力低下兒出生史的婦女組，高達1∶6(8/48)，提示對這樣的人群進行FMR1基因的篩查是非常有必要的，對有FXS兒出生史的婦女再次妊娠時需進行FMR1基因的產前診斷，避免再次FXS兒的出生。截至到目前，本研究已經成功幫助2名曾分娩FXS患兒的孕婦進行了產前診斷，成功地阻斷第二胎FXS患兒的出生，并發表了相關報道[27]。來自于韓國的15年的數據[24]也顯示高危婦女組PM的發生率高達1∶7.25，而對比低危婦女發生率僅為1∶1 955，與我們的數據非常相似。本研究中卵巢早衰組的PM發生率也較高，達1∶35，而反復生育失敗組的PM發生率僅為1∶369，但后者的發生率仍高于上述文獻報道的中國婦女一般人群的PM發生率[8，26]。通過這兩組與卵巢功能下降相關的病例數據，進一步證明了FMR1基因對于卵巢功能及人類的生育能力所具有的影響。而針對這一組存在卵巢功能異常的PM患者來說，生育計劃咨詢就顯得尤為重要，這部分患者不但存在著生育的異常，表現為不孕癥、反復生育失敗、IVF促排卵低反應及較低的妊娠率，而且即便是成功妊娠后也要積極支持妊娠同時建議進行產前診斷，如絨毛穿刺或是羊水穿刺，以了解胎兒的FMR1基因情況，及時阻斷FXS患兒的出生。所以對于表現為低生育力的育齡婦女來說，FMR1基因的測定不僅能從基因層面解釋可能的原因，同時在基因水平做到的優生優育及計劃生育，優化我國人口素質，應該推薦將其列入FMR1基因篩查人群。

本研究PM攜帶者CGG重復數>100者均出現在C組，即家族中可疑FXS患兒組，而卵巢早衰組和反復生育失敗組的CGG重復數均在55～100之間，這個也符合很多文獻發現的FXPOI的CGG重復數規律，即CGG重復次數與絕經年齡不存在線形或曲線關系，處于中等度重復數的PM攜帶者(80～100)發生FXPOI的風險更高，在CGG處于59～99范圍內時FXPOI的風險呈上升趨勢，而在CGG重復數>100后，發生風險反而下降。同樣進行促排卵時，CGG重復數>100者的卵巢反應率及妊娠率反而更高[28]。研究發現除了CGG重復數外，AGG的插入的減少也參與了卵巢功能的下降[29]。

本研究中共發現“灰區”患者15例，發生率為1∶148，且均出現在反復生育失敗的A組。但與東亞地區的正常人群“灰區”發生率相比并沒有明顯增高的趨勢，如韓國1∶143[24]、中國香港1∶88[26]，所以說“灰區”對于生育力的評估作用是值得商榷的。針對“灰區”婦女來說，不推薦進行產前診斷。而基于其在擴增時的不確定性，仍應建議她們在生育年齡時盡早完成生育計劃。

綜上所述，本研究通過測定中國反復妊娠失敗和卵巢早衰婦女FMR1基因的分布情況，獲得了我國特殊人群的流行病學數據，為臨床從基因水平診治卵巢儲備功能下降及卵巢早衰患者打開了新的視窗，FMR1基因無論是作為評估卵巢儲備功能的生物學指標，抑或是幫助醫生指導PM攜帶者的生育計劃及產前診斷方面都具有非常深遠的意義，為提高人口素質、降低出生缺陷提供切實的方法；同時也為進一步在我國多地展開更大樣本的正常人群的篩查提供了先期的經驗。