利用胚胎實時觀測技術預測早期胚胎的發育潛能

鄭愛燕，孟慶霞，丁潔，蒲艷，廖桂芝，李紅，王瑋

(南京醫科大學附屬蘇州醫院，蘇州市立醫院生殖與遺傳中心，蘇州 215002)

隨著囊胚培養技術的發展，通過囊胚培養可以選擇更具生長發育潛能的胚胎，提高胚胎種植率。但是，延長胚胎在體外培養和發育的時間，不僅會延長治療周期、增加治療成本，還會增加體外培養過程中可能導致的胚胎表觀遺傳學的改變和其它潛在風險。因此，我們希望能找到一種預測早期胚胎發育潛能的新方法。

胚胎實時觀測技術(Time-lapse)是一種瞬間曝光連續拍攝的成像技術，可以對胚胎進行動態監測。與傳統的形態學評分比，不僅能夠保證胚胎觀察評估過程中培養環境的穩定，而且可以獲得胚胎連續動態發育圖，觀測胚胎發育過程中的非正常發育行為，如多核、異常分裂、混亂分裂、逆分裂等，進而為選擇高發育潛能胚胎提供更多參考信息。研究表明利用Time-lapse得到的早期胚胎發育分裂時間點和異常發育行為可以預測囊胚形成和種植[1-4]，但是受培養體系和培養環境的影響，這些研究建立的模型并不適用于所有實驗室。因此，我們亟需利用Time-lapse技術找出胚胎形態動力學圖譜的特異參數，建立自己的Time-lapse預測模型。

本研究回顧性分析了2016年7月至2017年6月101例IVF Time-lapse周期，共687枚胚胎，其中532枚進行囊胚培養，分析了胚胎形態動力學圖譜和異常發育行為對可用囊胚及優質囊胚形成的影響，試圖利用Time-lapse尋找本中心培養體系和培養環境下預測早期胚胎發育潛能的指標。

資料與方法

一、研究對象

本中心2016年7月到2017年6月101例IVF Time-lapse周期，共687個胚胎，532枚胚胎進行囊胚培養，將這些養囊的胚胎根據發育速度和發育質量分為以下三組。A組：D3細胞數≥6，且胚胎碎片≤20%的胚胎，共385枚；B組：D3細胞數≥6，且胚胎碎片>20%的胚胎，共57枚；C組：D3細胞數<6的胚胎，共90枚。

二、研究方法

1.取卵受精：取卵后行常規IVF，精子濃度為5×106/ml，受精后4 h去除顆粒細胞。

2.胚胎培養：脫顆粒細胞的卵子放入 Embryoslide培養皿(Vitrolife，丹麥)，置于Embryo Scope 時差培養箱(Vitrolife，丹麥)進行培養，培養液為Global Total(LifeGlobal，美國)，培養箱環境：6.0% CO2，5.0% O2，37℃。設置拍攝間隔為10 min，連續拍攝6 d。

3.Time-lapse監測系統和胚胎評分：運用Viewer D圖像分析軟件，收集2PN 胚胎資料，記錄每個胚胎的原核消失時間(tPNf)和2細胞、3細胞、4細胞、5細胞、8細胞的細胞分裂時間點(t2、t3、t4、t5、t8)，同時觀察胚胎發育異常行為，包括多核(Multi Nucleation，MN)、異常分裂(Abnormal Cleavage，AC)和逆分裂(Reverse Cleavage，RC)。本研究用以評價胚胎形態動力學的變量包括：發育至2細胞、3細胞、4細胞、5細胞和8細胞的時間(t2、t3、t4、t5和t8)、cc2(t3-t2)、cc3(t5-t3)、s2(t4-t3)和s3(t8-t5)。囊胚評分用Gardner評分體系[5]，本中心的可用囊胚標準為3BC及以上級別胚胎；優質囊胚為3BB以上級別胚胎；非優質囊胚為不夠優質囊胚標準的可用囊胚； 廢棄胚胎為未長成可用囊胚的胚胎。

三、統計學分析

采用SPSS 16.0軟件進行統計學分析，組間均數比較采用t檢驗，率的比較采用卡方檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、D3不同發育速度和發育質量胚胎的囊胚形成

A組無論是可用囊胚形成率，還是優質囊胚形成率，均顯著高于B組和C組(P均<0.05)；B組的可用囊胚形成率顯著高于C組(P<0.05)，但是優質囊胚形成率在兩組間無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

二、D3不同發育速度和不同發育質量胚胎的形態動力學指標和異常發育行為

對于A組的胚胎，可用囊胚的t5、cc2和cc3顯著大于廢棄胚胎(P<0.05)，而t2、s2、s3、AC和RC

顯著小于廢棄胚胎(P<0.05)，其余指標在兩者間無顯著性差異(P>0.05)(表2)；進一步，在可用囊胚中，優質囊胚的t5、cc2、cc3顯著大于非優質囊胚(P<0.05)，s2、s3、AC和RC顯著小于非優質囊胚(P<0.05)，其余指標在兩者間無顯著性差異(P>0.05)(表3)。

表1 D3不同發育速度和發育質量胚胎的囊胚形成率[n(%)]

注：與其他兩組比較，*P<0.05；與C組比較，#P<0.05

表2 A組不同質量胚胎的發育速度及異常行為發生率[h，(x-±s),n(%)]

注：與廢棄胚胎組比較，*P<0.05。

表3 A組不同等級囊胚的發育速度及異常行為發生率[h，(x-±s),n(%)]

注：與非優囊胚組比較，*P<0.05

表4 B組不同質量胚胎的發育速度及異常行為發生率[h，(x-±s),n(%)]

注：與廢棄胚胎組比較，*P<0.05

對于B組，可用囊胚的cc2顯著大于廢棄胚胎(P<0.05)，其余指標在兩組間均無顯著性差異(P>0.05)(表4)。由于可用囊胚僅20枚，未對可用囊胚進一步分組比較。

對于C組，由于部分胚胎存在發育停滯，因此形態動力學時間點僅分析到t4。所有指標在兩者間均無顯著性差異(P>0.05)(表5)。同B組原因，也未對可用囊胚行進一步分組比較。

表5 C組不同質量胚胎的發育速度及異常行為發生率[h，(x-±s),n(%)]

討 論

本研究將胚胎根據D3形態學進行分組，探討不同類型D3胚胎的形態動力學和異常發育行為對囊胚形成的影響。結果顯示，就形態動力學而言，A組中，t5、cc2、cc3、s2和s3不僅能夠反映囊胚形成率，而且可以預測囊胚質量；在B組，僅cc2能提示囊胚形成；而在C組，并沒找到預測囊胚形成的有效指標。Conaghan等[6]將D3胚胎的形態學評分結合cc2、cc3，更好地預測了囊胚形成結局。Meseguer等[2]建立了一套預測胚胎種植能力的體系，在這套體系中，t5是主要指標，然后依次是s2、cc2。而Desai等[7]則認為tPNf、t2、t4、t8、s1、s2、s3和cc3均是預測囊胚形成的指標。可以看出，目前預測囊胚形成的形態動力學指標并不一致，我們推測可能原因是：(1)不同實驗室間培養液和培養環境存在差異。研究已證實胚胎培養液對Time-lapse數據存在影響[8]；(2)本研究將D3胚胎根據發育速度和發育質量進行了分組，發現各組間差異比較大，而已有文獻并未分組，因此可能研究的樣本間存在差異。值得一提的是，盡管s2和s3在B組中無顯著性差異，但是其值的變化趨勢與A組存在一致性。分析原因可能是B組樣本量不足所導致，如果將樣本量擴大，s2和s3可能會出現顯著性差異。

在異常分裂行為方面，A組中，AC和RC影響了囊胚形成與囊胚質量，而MN無此影響。這與以往大多數研究[9-11]結果一致。盡管如此，存在異常卵裂行為的胚胎，若發育至囊胚也具有一定種植能力，并可能出生健康嬰兒[12]。原因考慮AC1和AC2出現在胚胎發育的不同階段，在胚胎發育中排除異常細胞的階段不同，故而對整個胚胎發育的影響也不同。關于MN的影響，有研究認為在胚胎發育的早期階段，絕大多數MN胚胎具有自我修復能力，可以發育為正常二倍體囊胚[13]。另一些研究表明，兩細胞階段的MN會影響胚胎種植率和胎兒出生率[14]。我們認為這種不一致可能是收集MN的細胞階段和細胞內存在MN數量的不同引起的。一個卵裂球中出現兩個細胞核比出現多個細胞核染色體正常的概率更大[15]。本研究中，B組和C組的MN、AC和RC均不影響囊胚形成能力，但是由于這兩組樣本數量較少，要確定異常分裂行為是否對其囊胚形成存在影響，還有待進一步擴大樣本量進行研究。

綜上，本研究中，利用Time-lapse技術可以預測6細胞以上碎片少的形態學優質胚胎的發育潛能；而對于D3細胞數少或碎片多的形態學非優質胚胎，需擴大樣本進一步研究。另外，本文僅探討了Time-lapse系統中，胚胎形態動力學參數和異常發育行為對胚胎發育潛能的影響，關于這些指標是否影響胚胎種植率以及胚胎染色體核型，還需要進一步探討。