LC-MS/MS法測定比格犬血漿中米非司酮的方法學建立

郭永，賈重陽，許保海，3，涂鵬程，4，裴開顏*

(1.國家衛生計生委科學技術研究所，北京 100081；2.蘭州市第二人民醫院，蘭州 730046；3.遵義醫學院細胞生物學教研室，遵義 563003；4.北京協和醫學院，北京 100730)

米非司酮是1981年由法國Roussel-Uclaf公司首家生產的19-去甲睪酮衍生物，是一種受體水平的甾體類激素拮抗劑，與孕激素受體的結合力較黃體酮強6～8倍。自米非司酮作為終止早孕的藥物用于臨床以來，經過20多年的摸索實踐，米非司酮在臨床上得到廣泛運用，主要應用于終止早孕、緊急避孕、藥物流產[1]和治療子宮肌瘤[2-3]、子宮內膜異位癥[4-5]、庫欣綜合征[6]、胰島素抵抗[7]、乳腺癌[8]、子宮內膜癌[9]以及皮膚老化[10]等。米非司酮口服后吸收良好，但因存在肝臟首過效應，部分藥物被代謝而致生物利用度降低，故欲對其低劑量藥代動力學特征進行研究，則需要建立高效靈敏的分析方法。目前文獻報道的米非司酮檢測方法，多為高效液相色譜(HPLC)法[11-13]和放射免疫分析法(RIA)[14]等。隨著分析技術的不斷進步，液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)應用于臨床化學的檢測領域，由于LC-MS/MS法分析速度快、靈敏度高，近年來被認為是痕量定量分析的金標準。本文旨在建立一種簡單快捷、靈敏度高的LC-MS/MS法測定比格犬血漿中米非司酮的濃度，為進行口服低劑量(25 mg)米非司酮片的人體藥動學研究奠定基礎。

材料和方法

一、動物及材料

1.實驗動物：比格犬，雌性，普通級，8～12 kg，購自北京瑪斯生物技術有限公司，實驗動物生產許可證號為SCXK(京)2016-0001。試驗動物檢疫觀察14 d，觀察動物的外觀體征、行為活動、糞便性狀、體重及飲食等指標，發現有病動物及時剔除。動物使用前經動物管理人員和專題負責人檢查認可。

動物房環境條件控制室溫18℃～24℃，相對濕度40%～70%，光照12 h明暗交替。籠具、食盒、飲水瓶每天沖洗一次，動物房地面和墻面每周消毒一次，用0.1%新潔爾滅或0.5%的84消毒液擦拭消毒，兩種消毒液交叉使用。普通飼料為犬維持料，購自北京華阜康生物科技股份有限公司。飲水：飲用純化水，經酸化后自由飲用。

2.儀器：API 4000 Qtrap液相色譜-質譜聯用儀(AppliedBioSystem，美國)，包括：API 4000 Qtrap三重四極桿質譜、配有ESI源、Analyst 1.5.2數據處理系統；液相部分為Agilent1200高效液相色譜，配有G1312A二元溶劑輸送泵、G1367A自動進樣器、G1379A脫氣機、G1316A柱溫箱。十萬分之一分析天平DENVER Instrument TB-25(max 21 g，d=0.01 mg)；美國Labnet VX-100渦旋振蕩器(VORTEX)；低溫高速離心機5810R(Eppendorf，德國)；4℃、-20℃、-80℃ 冰箱(青島海爾)。

3.試劑：米非司酮標準物質：純度>99%，批號72801608006(秦皇島紫竹藥業)；內標物特非那定(Sigma，美國)；甲醇(批號170237)、甲酸(批號174477)、乙腈(批號168772)、DMSO(批號155977)、甲基叔丁基醚(MTBE，批號166804)均為色譜純(Fisher Scientific，美國)。

4.對照品溶液的制備：(1)首先配置標準品母液，用DMSO配制1 mg/ml的米非司酮溶液備用。(2)標準溶液的配置：由1 mg/ml的米非司酮母液用甲醇依次稀釋成標準系列濃度(10、20、50、200、500、2 000、5 000、10 000 ng/ml)的溶液。(3)標準曲線濃度點為：1、2、5、20、50、200、500、1 000 ng/ml。

5.內標溶液制備：用甲醇/乙腈(1/1，v/v)溶液將特非那定母液稀釋成濃度為50 ng/ml的內標溶液備用。

6.質控(QC)標準溶液：最低定量下限(LLOQ)、低、中、高四標準溶液濃度為：10、20、500、8 000 ng/ml，LLOQ、低、中、高四濃度點分別為：1、2、50、800 ng/ml。

7.試劑的保存：4℃保存。

二、方法

1.給藥及血漿樣本采集：(1)靜脈給藥：比格犬，3只，雌性，靜脈注射米非司酮1 mg/kg。給藥前及給藥后5、15、30 min，1、2、4、8、12、24、48、72、96 h采集血漿樣本。(2)單次灌胃給藥：比格犬，雌性，每給藥劑量3只，分別給予米非司酮灌胃1、3、10 mg/kg。給藥前及給藥后15、30 min，1、2、4、8、12、24、48、72、96 h采集血漿樣本。(3)多次灌胃給藥：比格犬，3只，雌性，分別給予米非司酮灌胃3 mg/kg，給藥間隔4 d或7 d，連續給藥7次。首次和末次給藥前，給藥后15、30 min，1、2、4、8、12、24、48、72、96 h以及第7、14、21、28、35、42 d采集血漿標本。

對照組血漿樣本采自非靜脈及灌胃給藥的比格犬。標本采集后EDTA抗凝，24 h以內的血漿保存于-4C冰箱，24 h以后凍存于-80C冰箱。

2.色譜條件：色譜柱：Kinetex-C18 110 A column(3 mm×30 mm ID，2.6 μm，phenomenex)；流動相：A相，甲醇(含0.1%甲酸)；B相，水(0.1%甲酸)；流速：0.8 ml/min；梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

3.質譜條件：以多反應監測模式(MRM)監測離子對(米非司酮：430.2→372.3；內標特非那定：472.2→436.2)的離子流。離子噴霧電壓5 500 V；離子源溫度為550℃；離子源Gas1 60 psi；離子源Gas2 60 psi；氣簾氣12 psi。

4.標準曲線的制備：取空白血漿50 μl，加入10 μl 50 ng/ml的特非那定內標溶液，再加入5 μl標準溶液，500 μl的甲基叔丁基醚(MTBE)，充分渦旋3 min后，4 000 r/min離心10 min，取上清400 μl，氮氣吹干后，用150 μl的甲醇/水(1∶1)復溶，充分渦旋1 min后直接進樣。

5.QC樣品的制備：取空白血漿50 μl，加入10 μl 50 ng/ml的特非那定內標溶液，再加入5 μl標準溶液，500 μl的MTBE，充分渦旋3 min后，4 000 r/min離心10 min，取上清400 μl，氮氣吹干后，用150 μl的甲醇/水(1∶1)復溶，充分渦旋1 min后直接進樣。

6.回收率樣品的制備：取空白血漿50 μl，加入10 μl甲醇/乙腈(1/1，v/v)，再加入5 μl 甲醇溶液，500 μl的MTBE，充分渦旋3 min后，4 000 r/min離心10 min，取上清400 μl，氮氣吹干后，加入4 μl標準溶液，加入8 μl 50 ng/ml的特非那定內標溶液，再加入138 μl的甲醇/水(1∶1)，充分渦旋1 min后直接進樣分析。

7.基質效應樣品的制備：取50 μl水，加入10 μl甲醇/乙腈(1/1，v/v)，再加入5 μl甲醇溶液，500 μl的MTBE，充分渦旋3 min后，4 000 r/min 離心10 min，取上清400 μl，氮氣吹干后，加入4 μl標準溶液，加入8 μl 50 ng/ml的特非那定內標溶液，再加入138 μl的甲醇/水(1∶1)，充分渦旋1 min后直接進樣分析。

8.專屬性檢測：取6份不同來源比格犬空白血漿。將實驗比格犬空白血漿分析色譜圖與加藥后比格犬血漿色譜圖進行比較，觀察比格犬血漿液液萃取后有無內源性干擾物質，對待測物和內標物峰形有無明顯干擾。

9.標準曲線線性范圍：血漿中藥物標準曲線濃度點為1、2、5、20、50、200、500和1 000 ng/ml。以米非司酮的濃度X(ng/ml)為橫坐標，以米非司酮的峰面積和內標峰面積的比值Y為縱坐標，用加權最小二乘法(W=1/X2)進行回歸計算，所得直線回歸方程即為標準曲線。定量下限是標準曲線上的最低濃度點。

10.精密度(RSD)與準確度(RE)：選擇LLOQ、低、中、高4個濃度點(1、2、50和800 ng/ml)，平行樣6份，作為日內RSD。連續檢測3 d，作為日間RSD。隨行標準曲線，以當日的標準曲線計算QC樣品的濃度，采用單因素方差分析法計算RSD和RE。

11.穩定性檢測：本實驗通過比較樣品在5種存放條件下的準確度，檢測樣品在分析前、中、后期的穩定性。(1)血漿樣品室溫放置5 h，低、高兩個濃度點平行樣6份；(2)血漿樣品3次冷凍、解凍循環穩定性，低、高兩個濃度點平行樣6份；(3)血漿樣品-80℃長期穩定性40 d，低、高兩個濃度點平行樣6份；(4)血漿樣品處理后4℃放置24 h穩定性，低、高兩個濃度點平行樣6份；(5)米非司酮和內標儲備液4℃ 40 d儲存穩定性，兩個不同日期溶液平行樣6份。

12.提取回收率：低、中、高三濃度點(2、50和800 ng/ml)平行樣6份，通過QC樣品平均峰面積比相應濃度的回收率樣品的峰面積，計算每個濃度樣品和內標的回收率。

13.基質效應：低、中、高三濃度點(2、50和800 ng/ml)平行樣6份，采集峰面積C，通過公式B/A×100%計算基質效應。

14.血漿樣品稀釋可靠性：配置濃度為4 000 ng/ml血漿樣品，將其稀釋5倍，平行樣6份。

結 果

一、方法專屬性

將實驗比格犬空白血漿分析色譜圖(圖1)與加藥后比格犬血漿色譜圖(圖2)進行比較，分析結果顯示比格犬血漿液液萃取后無內源性干擾物質，對待

A：米非司酮；B：內標圖1 比格犬空白血漿色譜圖

A：米非司酮；B：內標圖2 加藥后比格犬血漿色譜圖

測物和內標物峰形無明顯干擾。該LC-MS/MS方法的專屬性較好，米非司酮保留時間為2.11 min，特非那定保留時間為2.22 min(圖2)。

二、標準曲線與定量下限

通過配制的不同濃度樣品進樣分析，記錄色譜圖(圖3、4)，通過直線回歸計算，得出直線回歸方程，

A：米非司酮；B：內標圖3 標準曲線1 ng/ml色譜圖

A：米非司酮；B：內標圖4 標準曲線1 000 ng/ml色譜圖

即為標準曲線。結果顯示：標準曲線相關系數4次均>0.99，說明米非司酮在1～1 000 ng/ml范圍內線性關系良好。方法靈敏度方面，LLOQ為1 ng/ml，信噪比(S/N)>10。LLOQ RSD為10.4%，RE為99.6%(表2，圖5)。

三、RSD與RE

實驗結果如表3所示，QC樣品的日內RSD≤11.6%，日間RSD≤9.9%，日內RE≤11.1%，日間RE≤7.8%。結果顯示，該方法符合FDA生物樣品分析方法指南的要求，重復性較好，可用于檢測比格犬血漿中的米非司酮。

四、穩定性

本實驗通過比較樣品在5種存放條件下的準確度，檢測了樣品在分析前、中、后期的穩定性。存放條件包括：室溫放置5 h、4℃放置24 h、-80℃反復凍融3次、-80℃長期穩定性40 d以及米非司酮和內標儲備液4℃ 40 d儲存穩定性。實驗結果顯示，儲備液室溫放置5 h穩定(RE：-5.42%～-4.19%)，4℃放置24 h穩定(RE：-3.75%～-2.72%)，-80℃反復凍融3次穩定(RE：-5.42%～-7.10%)，長期穩定(RE：-0.42%～0.48%)，以及米非司酮和內標儲備液4℃ 40 d儲存穩定(表4)。實驗結果顯示，待測物基本沒有被降解，在整個實驗過程中基本穩定。

表2 LLOQ數據表

A：米非司酮；B：內標圖5 LLOQ色譜圖

批 次濃度(ng/ml)加入量測得量RSD(%)RE(%)批內1次1 1.03±0.113.0211.602 1.87±0.19-6.7511.105044.97±1.91-10.104.65800859.33±34.057.424.34批內2次1 0.89±0.06-11.107.532 1.89±0.17-5.5810.005054.05±3.368.106.80800737.83±67.74-7.7710.10批內3次1 0.92±0.08-7.7010.002 1.78±0.06-11.103.955047.58±1.83-4.834.22800717.83±26.56-10.304.05批間1 0.95±0.07-5.267.772 1.85±0.06-7.813.145048.90±4.69-2.279.57800771.67±76.29-3.549.92

表4 米非司酮和內標儲備液4℃ 40 d儲存穩定性

五、基質效應和提取回收率

結果顯示，米非司酮在比格犬血漿的基質抑制率均<15%(表5)，表明不存在明顯的基質效應；通過公式C/B×100%計算提取回收率，結果顯示米非司酮回收率為91.5%～104.0%(表5)。

六、稀釋效應

配置濃度為4 000 ng/ml血漿樣品，將其稀釋5倍，稀釋后濃度800 ng/ml，平行做6份(濃度測定值分別為806、723、724、720、827、697 ng/ml)。結果顯示RSD 7.10%，RE -6.31%，均符合要求。

表5 LC-MS/MS法測定米非司酮的基質效應和回收率

討 論

米非司酮是一種抗孕激素，鑒于其可作用于月經周期不同時相，且半衰期較長，研究人員考慮將其用于常規避孕。本課題組曾對25 mg和50 mg米非司酮每周一次口服的臨床效果進行初步研究[15]。并在此基礎上，又在全國7家研究所/醫院完成了對502名婦女(3 006個研究周期)每周一次口服25 mg米非司酮的臨床觀察[16]。研究結果均提示有希望將米非司酮每周一次口服發展為常規避孕方法。另一方面，體內外研究均表明米非司酮對于子宮肌瘤等具有很好的治療作用，但目前適宜劑量和方案尚在探索之中。鑒于米非司酮每周一次口服的避孕效果，及其對多種疾病的治療作用，考慮可將其用于特定人群，如子宮肌瘤、子宮內膜異位癥患者，發揮避孕和治療疾病的雙重功效。目前已獲得國家食品藥品監督管理局(CFDA)認證，藥物說明書中明確的僅為將10 mg米非司酮用于成年育齡女性有中重度癥狀的子宮肌瘤術前治療。同時，鑒于根據CFDA頒布的《藥品注冊管理辦法》(局令第28號)，在進行臨床試驗之前，需要對米非司酮避孕適應癥進行臨床前研究，評價其安全性和有效性，因此有必要進行每周一次口服25 mg米非司酮的藥代動力學研究，為米非司酮作為兼有治療作用的避孕藥物申請臨床研究做準備。

目前報道的生物樣本中米非司酮的分析測定方法主要有HPLC法[11-13]和RIA[14]。這兩種方法試劑價格昂貴、步驟繁瑣；RIA法因存在放射性污染，且操作較為煩瑣，不宜推廣使用；HPLC雖然測定較為準確，但仍存在標本流動相配置復雜，檢測時間長，LLOQ較高等問題[17-18]。楊林等[19]采用LC-MS/MS法測定人血漿中米非司酮濃度，其LLOQ值為10 ng/ml，上樣量為200 μl。林琳等[20]也采用LC-MS/MS法測定兩種米非司酮片人體生物學效性，其LLOQ值為10.29 ng/ml，上樣量為200 μl。研究文獻中報道的LC-MS/MS法，靈敏度雖已較高，但仍不能滿足本研究對低劑量米非司酮藥代動力學研究的需要，且部分方法操作較為煩瑣，有待于進一步簡化。

本研究在靈敏度、樣品前處理和樣本需求量等方面進一步優化分析條件，所建立的LC-MS/MS法測定比格犬血漿中的米非司酮，線性范圍寬(1 000倍)，靈敏度高，血漿中米非司酮的線性范圍均為1～1 000 ng/ml，樣品回收率高，能夠滿足給藥后各個時間點血漿藥物濃度的測定。在本測定條件下的穩定性考察中，米非司酮含藥基質的各濃度偏差均在±15%以內，能夠保證檢測結果的準確性和重現性。本研究所建立的分析方法靈敏度可達1.0 ng/ml，且所需樣本量僅為血漿50 μl，為進行每周口服25 mg米非司酮片的人體藥動學研究奠定基礎。