不同雜種松產脂力及松脂成分的變異研究

吳東山, 楊章旗*, 黃永利

(1.廣西壯族自治區林業科學研究院，國家林業局馬尾松工程技術研究中心，廣西馬尾松工程技術研究中心，廣西 南寧 530002； 2.廣西南寧市林業科學研究所， 廣西 南寧 530100 )

澳大利亞雜交松是濕地松(Pinuselliottii.,PEE)和加勒比松(Pinuscaribeae)雜交松的后代，簡稱為F1代。昆士蘭林業研究所在澳大利亞雜交松的人工雜交育種過程中，注意選擇速生、抗旱性強、材質優的樹種作為親本，進行了不同組合的雜交，如濕地松與洪都拉斯加勒比松(P.caribaeavar.hondurensis, PCH)雜交的PEE×PCH，濕地松與巴哈馬加勒比松(P.caribaeavar.bahamensis,PCB)雜交的PEE×PCB，濕地松與洪都拉斯加勒比松雜交的PEE×PCH(種源間)，濕地松與雜交一代雜交的 PEE×(PEE×PCH)，雜交一代與巴哈馬加勒比松雜交的(PEE×PCH)×PCB等雜交育種工作[1]。這些不同的雜種松表現出干形圓滿通直、適應性強、生長迅速的雜種優勢[2]。松脂是松樹除了板材之外最重要的經濟產品，我國自上世紀80年代引種雜交松以來，先后進行了各個類型的引種栽培試驗和選育工作[3>-7]。但雜交松的松脂研究開展得較少，梅杰娜等[2]研究了濕地松、加勒比松、雜種松3種松脂，結果表明雜種松松脂中樅酸型樹脂酸及蒎烯含量較雙親低；龐正轟等[8]研究了PEE×PCH雜種及其親本濕地松、加勒比松的松脂表明三者成分上沒有顯著差別。國內引種的PEE×PCH、PCH×PEE、PEE×PCB、(PCH×PEE)×PEE、PCH×(PCH×PEE)雜種中PEE×PCH雜種的生長性狀表現最為優良，其他雜種在生產上也具有較優良的潛力[9]。這些優良的雜交種的松脂成分的研究較少，因此本研究對從美國西海岸引種的濕地松、巴哈馬引種的加勒比松、洪都拉斯引種的加勒比松及其雜交F1代、回交雜種5種類型松樹的松脂成分進行對比分析，以期為更充分開發雜交松松脂資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與原料

采脂測定林位于廣西省南寧市林科所國家馬尾松良種基地，北緯23°10′，東經108°00′，屬熱帶北緣季風氣候，干濕季節明顯，年平均氣溫21.5 ℃，1月平均氣溫12.5 ℃，年平均有霜日23天，年降雨量 1 246 mm，土壤為第四紀紅土發育而成的中壤質厚層赤紅壤，土層厚1 m以上，pH值4.5～5.0，試驗地海拔120 m左右，地勢平坦。共從澳大利亞引種5種濕地松與加勒比松的雜種后代：正交PEE(濕地松)×PCH(洪都拉斯加勒比松)、反交PCH×PEE、PEE×PCB(巴哈馬加勒比松)、(PCH×PEE)(或F1)×PEE、PCH×(PCH×PEE)(或F1)，并于1990年營造，對照樣為PEE、PCH、PCB。試驗林造林設計采用隨機區組設計，每個小區種植6株，4次重復。

HP6890氣相色譜儀，美國Agilent公司；GCMS-QP5050A型氣相色譜-質譜聯用儀，日本島津公司。無水乙醚、無水硫酸鈉均為分析純；水為二次蒸餾水。

1.2 調查內容與統計分析方法

在進行不同雜種松產脂力比較時，采用常規生產下降式采脂法[10]采脂，采割負荷率在35%～45%之間，每1天采割1次，采脂時間為2011年8月15日至10月1日，實際采脂天數為37天，每次分單株記錄松脂的質量(即產脂量)，因產脂量是生產上的最終核算指標，林木遺傳學上認為產脂量主要由林木本身的特性決定，由此產脂量與采割面等技術操作的關系不大，而松樹的產脂力主要受松樹本身的遺傳控制，因此為了生產及育種改良研究的需要使用產脂量和產脂力來進行比較分析。試驗中有關數據的方差統計分析、相關分析均采用SAS(6.12版)軟件[11]完成。

1.3 松脂樣品采集與主要化學組成測定

1.3.1樣品采集 在進行不同雜種松松脂成分的比較時，采用鉆孔法在樹高、胸徑相近的單株上采集樣品。將當天采回的新鮮松脂(密封保存)，在實驗室中進行甲酯化處理。另取部分松脂進行減壓蒸餾分離出松香和松節油。

1.3.2樣品處理及分析 將直接采集到的松脂攪拌均勻，各取約0.4～0.5 g于燒杯內，加入6～7.5 mL無水乙醇溶解，過濾于具塞試管中，加入0.5%的酚酞作為指示劑，用25%四甲基氫氧化銨水溶液滴至紅色，30 s不退色[12]即視為松脂中的樹脂酸完全甲酯化。加入少量無水硫酸鈉作吸水劑，高速離心機10 000 r/min離心分離2 min，將處理好的試樣取上層清液放置4 h后做GC-MS分析，取實驗中分離得到的松節油和甲酯化試劑做校正誤差和空白對照。

氣相色譜條件[13]:色譜柱DB-5毛細管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)，分析條件為程序升溫初始溫度60 ℃(保持2 min)，以4 ℃/min的升溫速率升至260 ℃(保持10 min)，汽化室和檢測器溫度均保持在260 ℃[13]。氫火焰離子檢測器(FID)，載氣為高純氮，氮氣壓力0.1 MPa；氫氣流速50 mL/min，空氣流速50 mL/min，分流比1∶50，進樣量為0.3 μL。

質譜分析條件：離子源EI，電子能量70 eV，離子源溫度250 ℃，掃描范圍50～150 u，掃描時間0.2 s，進樣量0.3 μL。

1.4 數據處理

松脂各組成的百分含量為扣除溶劑峰后剩余所有峰面積總和作為基準，取各個組分的平均值按照面積歸一化法進行計算。所得的質譜圖直接與該機中的NIST數據庫檢出的標準圖譜進行對比，并參照相關文獻[14～17]進行定性分析，少數峰則依據相對保留時間和質譜數據與標準樣品的數據相結合進行定性。

2 結果與分析

2.1 雜交松及對照的產脂力和松脂產量分析

在引種的國外松中，濕地松、加勒比松及其雜交種屬于產脂量較高的樹種。從表1的濕地松與加勒比松不同雜種的產脂力及產脂量分析結果可看出：雜交F1代中PEE×PCB在十月份產脂力低于親本PEE，以及回交代(子代與親本雜交的產物)雜種PCH×F1產脂力在八月份低于親本PCB，其余雜交種及回交子代的產脂力在各個月份間均高于濕地松、加勒比松對照。與對照比較，不同的雜種松樹在不同的月份中產脂量有不同的變化，雜種PEE×PCH在所有月份的產脂量均高于3個親本對照，雜種 PCH×PEE在不同月份間產脂量呈曲線型變化，但產脂量均低于親本PEE，說明該種的產脂量相對于親本PEE來說不具有優勢，雜種PEE×PCB 的產脂量變化與雜種PCH×PEE類似，其一個顯著特征就是相對于親本PCB不具有雜種優勢，因此，在進行遺傳改良設計時應當進行適當的選擇，篩選出具有雜種優勢的個體。在整個采脂周期內，PEE×PCH、PCH×PEE、PEE×PCB、(PCH×PEE)×PEE、PCH×(PCH×PEE)雜種產脂力分別取平均值比3個對照均值高74.55%、 23.27%、 37.19%、 65.26%、 46.71%。比較雜交F1代和回交代發現，PEE×PCH雜種產脂力及產脂量表現最好。

表1 各雜種與對照產脂力及產脂量統計

表2為不同雜種松樹產脂力及產脂量的方差分析，比較對照親本與雜交后代的產脂力值以及表2產脂力及產脂量的方差分析可知，產脂力以及產脂量在不同雜種間均達到顯著差異，20年生時馬尾松人工林分已達成熟期，產脂力性狀在親本和子代中的表現已處于相對穩定水平。各雜種產脂力高于其親本平均產脂力，表明存在雜種優勢，通過雜交手段可以提高松脂產量。

表2 各雜種與對照產脂力及產脂量方差分析

1)**:0.01顯著水平；*：0.05顯著水平；下同**： the significant level of 0.01; *: the significant level of 0.05;similarly hereinafter

通過應用產脂力及產脂量的數據進行多重分析軟件比較不同雜種松脂在2個性狀指標上的差異程度來說明雜種間及相對于親本對照的優劣性，根據多重比較軟件的分析規則是帶有相同字母的性狀表示差異不顯著，帶有不同字母的性狀表示差異顯著。結合表1統計數據以及表2的方差分析，多重比較結果如表3所示，表3中的產脂力和產脂量是針對整個采脂周期內不同雜種松樹的比較，分別取每個樹種在整個周期內產脂力及產脂量的總和數據分2個顯著等級進行比較，產脂力在0.05水平時，PEE×PCH雜種表現最優，與其他雜種及對照差異顯著，洪都拉斯加勒比松的產脂力最低，且與其他雜種差異顯著；在0.01水平上，PEE×PCB雜交種與回交雜交種F1×PEE產脂力差異顯著，F1代與回交代比較，PEE×PCH除了與回交代F1×PEE差異不顯著外，其余雜種均存在顯著差異。在產脂量方面，PEE×PCH雜種在2個顯著性水平上都表現出與其他樣本顯著的差異，F1×PEE回交雜種也具有較好的生產潛力，其他雜種與親本產脂量差異不顯著。

表3 不同樹種(雜種)產脂力及產脂量的多重比較1)

1) 小寫字母表示0.05水平差異顯著，大寫字母表示0.01水平差異顯著lowercase indicates the significant level of 0.05,capital letter indicates the significant level of 0.01

2.2 雜交松及其對照松脂性狀的比較

通過氣相色譜-質譜聯用分析技術共分析得到各雜種松及其對照松脂組分58種，占總分析量的97%以上，主要組分共17種(峰型面積大于0.01%的組分，見表4)，其峰型面積總和占總峰型面積的91%以上，其中主要單萜烯化合物8種，分別為α-蒎烯、β-蒎烯、莰烯、月桂烯、3-蒈烯、對傘花烴、檸檬烯、β-水芹烯，峰型面積在23.38%～34.01%之間；主要二萜樹脂酸化合物9種，分別為異海松酸、海松酸、濕地松酸、山達海松酸、左旋海松酸、長葉松酸、去氫樅酸、樅酸、新樅酸，峰型面積在62.50%～71.41%之間。除了單萜烯及二萜樹脂酸之外的非烯類、二萜醛、二萜醇等少量物質的其他成分平均峰型面積在0.78%～3.54%之間。對各雜種松及親本的含油量進行研究發現，松脂的含油量與單萜烯及二萜樹脂酸主要成分表現出不同的變化規律。松脂含油量(松節油得率)在13.29%～31.02%之間，含油量較高。PEE×PCH雜種、F1×PEE雜種以及濕地松對照的含油量高于廣西優良馬尾松松脂含油量[18]，巴哈馬加勒比松以及洪都拉斯加勒比松含油量均低于15%，在不同雜種中，PCH×PEE反交雜種表現較差，僅高于加勒比松單親本含油量，而PEE×PCH正交雜種的含油量超過雙親本，具有優良的雜交表現。在回交雜種中，濕地松做親本的雜種含油量高于加勒比松做親本的雜種，另外，加勒比松做親本時的回交雜種含油量比親本加勒比松高45.4%。在F1代方面，表現較差的雜種PCH×PEE也比加勒比松親本含油量高24.6%，這些結果表明，除了雜種PEE×PCH對雙親本都具有雜種優勢外，其他雜交種在含油量性狀上相較于雙親本不全具有雜種優勢，回交雜種F1×PEE、PCH×F1相對于雜種一代PEE×PCH、PCH×PEE、PEE×PCB的含油量差異更小，雜種一代的變異更為豐富。

表4 各雜種與對照松脂含油量及松脂主要成分統計

分析不同雜種及對照發現，松脂主要的單萜烯化合物中，α-蒎烯、β-蒎烯峰型面積總比例超過19%，在主要單萜烯含量方面，雜種一代PEE×PCH、 PCH×PEE、 PEE×PCB中濕地松做母本時具有明顯的雜種優勢，此時雜交種表現的是高于母本的單親雜種優勢，對父本不做要求，主要單萜的含量平均比親本均值高2.73%，其中除了雜種PEE×PCH和PCH×PEE的α-蒎烯含量低于親本PCH外，PEE×PCB的雜種優勢明顯，月桂烯、 3-蒈烯、對傘花烴、檸檬烯相對于親本濕地松不具有雜種優勢。從β-蒎烯、莰烯、β-水芹烯峰型面積比例看， PCH×PEE的β-蒎烯小于PEE和PCH，PEE×PCH的莰烯和β-水芹烯小于PEE及PCH，以上幾個組合雜種不具備雜種優勢，其余β-蒎烯、莰烯、β-水芹烯中PEE×PCH、 PCH×PEE具有雜種優勢，且在3個雜種一代中，PEE×PCH的β-蒎烯的含量最高，遠高于其他2個雜種，并超過濕地松親本109.10%，而回交雜種一代F1×PEE和PCH×F1的表現則有不同的規律，濕地松做親本時，β-蒎烯的含量高于PCH×F1及親本濕地松、加勒比松含量。PCH×F1的莰烯、月桂烯、對傘花烴、β-水芹烯不具有雜種優勢，3-蒈烯、檸檬烯均具有雜種優勢，且檸檬烯的雜種優勢最明顯，PCH×F1雜種中檸檬烯的量達到3.04%，其在親本中的量分別為1.46%和2.32%，分別高出濕地松、加勒比松親本108.22%及31.03%。另外，一般情況下，濕地松和加勒比松松脂中，除了成分α-蒎烯和β-蒎烯以外，主要還含有β-水芹烯，但在松脂樣品中發現回交代雜種中含有少量的檸檬烯成分，且其含量超過了β-水芹烯的含量，通過GC-MS分析圖譜檢索及檸檬烯和β-水芹烯的標準品進行GC疊加分析，進一步證實了兩者的出峰位置和順序。這說明雜交既增加了松脂的含油率，同時也改變了松節油的組成特性，推測遺傳基因在雜交時發生了改變。在主要二萜樹脂酸方面，不同雜種松中只有PCH×F1的總含量與親本有顯著的差異，雜種PEE×PCH及F1×PEE的濕地松酸成分均低于濕地松及加勒比松親本，表明在這2個雜種中濕地松做親本的表現均沒有雜種優勢。在回交雜種F1×PEE、 PCH×F1中，樅酸和新樅酸的含量均具有明顯的雜種優勢。結合來看，濕地松和加勒比松通過雜交和回交之后，松脂中松節油的變化較為明顯，一些原來在親本中含量微小的物質得到增加，并增加了松脂的含油率，初步的實驗推測可能存在雜交過程中基因突變的發生。

各雜種與對照松脂含油量及松脂成分的方差分析表明(表5)，松脂的含油量、β- 蒎烯、檸檬烯、左旋海松酸、去氫樅酸、新樅酸含量存在顯著的差異，說明雜交育種手段對這些松脂成分的合成與分泌產生了積極的影響，因此，通過針對性的雜交育種技術有可能得到松脂中某些組分的富集。

表5 各雜交組合與對照松脂含油量及松脂主要成分方差分析

2.3 PEE×PCH組合產脂力及松脂主要成分相關分析

根據上述松脂分析結果表明，PEE×PCH雜種的松脂產量、產脂力、性狀表現最為突出，為了分析雜種組合中松脂產脂力及組分之間的關聯程度以便在后期的雜交育種中進行合理的篩選優良雜交個體，根據分析法則性狀之間的關聯程度分別以不相關、弱相關、顯著相關表示。采用SAS統計分析軟件對雜種松的產脂力與松脂主要成分進行相關分析，結果見表6。

表6 PEE×PCH組合產脂力及松脂主要成分相關分析

結果表明產脂力與松脂含油量及松脂主要成分相關性不顯著，其中產脂力與單萜烯烴中檸檬烯表現出弱負相關關系。樅酸型樹脂酸與海松酸型樹脂酸及α-蒎烯相關性不顯著。含油量與β-蒎烯、左旋海松酸呈極顯著相關，與檸檬烯為顯著相關；在單萜烯烴中，僅有β-蒎烯與檸檬烯有顯著相關，雙萜類化合物中，僅有左旋海松酸與β-蒎烯、檸檬烯呈顯著正相關。從松脂組分中單萜及二萜主要化合物的相關性分析可知，各組分之間的相關性程度的緊密性，另外，松脂的含油量、松脂產量、松脂組分受到不同程度的遺傳基因控制，這為高應用價值組分在林木育種上的協同改良提供了可能的方案。

松樹產脂力及松脂組分的研究已經取得了不少的成果，通過雜交育種方法來提高松脂的產量及改良松脂的組分是一個重要而有效的途徑。通過對不同雜種松樹松脂的進一步研究，初步揭示了松脂產脂力、松脂產量、松脂中各個主要成分的相對變化情況，能夠為高產脂、高經濟松脂組分的雜交育種策略的制定提供數據參考。

3 結 論

3.1濕地松與加勒比松的種間雜交是目前松樹雜交育種中最成功的案例，其雜交品種表現出優良的產脂性能。通過比較各雜種與對照的產脂力及產脂量發現，產脂力及產脂量在不同的雜交種及對照上都存在顯著的差異，各雜種的產脂力均高于對照樹，在整個采脂周期內，PEE×PCH、PCH×PEE、PEE×PCB、(PCH×PEE)×PEE、PCH×(PCH×PEE)雜種產脂力分別比3個對照均值高74.55%、23.27%、37.19%、65.26%和46.71%。F1代中正交雜種產脂力高于反交雜種，而回交雜種產脂力又高于反交雜種，但在所有參試材料中，PEE×PCH雜種產脂力及產脂量表現最好。

3.2從不同的雜種的松脂含油量及松脂成分與對照比較來看，也存在不同程度的差異。其中松脂含油量、β-蒎烯、檸檬烯、左旋海松酸、去氫樅酸、新樅酸存在顯著的差異，且不同的雜交種松脂都表現出較高的β-蒎烯、檸檬烯含量特征。PEE×PCH正交雜種的含油量超過雙親本，具有優良的雜交表現。

3.3最優雜種PEE×PCH的松脂產脂力及松脂成分的相關分析表明，產脂力與松脂含油量、松脂組分相關指數為-0.141～0.643，顯著性檢驗結果為相關性不顯著，含油量與β-蒎烯、左旋海松酸的相關指數分別為0.002及0.009，達到極顯著相關水平，而且含油量與檸檬烯的相關指數為0.012，達到顯著相關水平；樅酸型樹脂酸與海松酸型樹脂酸、單萜烯烴之間的相關性指數為-0.843～0.76，相關性不顯著。這說明了松樹的產脂力與含油量及松脂組分可能受到不同的遺傳基因控制，而含油量與松脂的組分上受到遺傳基因控制的關聯性更密切，因此，建議在進行松脂性狀遺傳改良過程中應當給予此類關聯性密切的基因型性狀更多的關注。