三黃雞免疫重組禽流感病毒(H5+H7)二價(jià)滅活疫苗血清抗體檢測試驗(yàn)報(bào)告

禽流感（avian influenza，AI）是禽流感病毒（AIV）感染家禽后引起的各種綜合征，從無臨床癥狀感染到呼吸道疾病和產(chǎn)蛋下降，到死亡率接近100%的嚴(yán)重全身性疾病不等。根據(jù)禽流感病毒的致病性和毒力的不同，可將其分為高致病性禽流感（HPAI），低致病性禽流感（LMPAI）。高致病性禽流感可導(dǎo)致嚴(yán)重的家禽群體發(fā)病和死亡，不僅給家禽養(yǎng)殖業(yè)帶來毀滅型的打擊，還可以不斷地跨種間傳播感染人類，人感染后死亡率高達(dá)60%。其中H5N1與H7N9就是近年兩種常見人禽共患禽流感病毒亞型。且H7N9流感病毒已由原來的對(duì)禽的低致病性變異為高致病性，自2016年12月～2017年5月，兩廣地區(qū)出現(xiàn)暴發(fā)式禽流感H7N9疫情，并且多地有人感染H7N9的報(bào)道。我國決定從2017年秋季起，在家禽全面免疫禽流感H5的基礎(chǔ)上，逐步全面開展H7N9免疫。為了解重組禽流感病毒(H5+H7)二價(jià)滅活苗免疫在不同地區(qū)不同養(yǎng)殖場的免疫效果，本試驗(yàn)團(tuán)隊(duì)于2017年10月，在賀州市隨機(jī)選取了4個(gè)三黃雞養(yǎng)殖場開展了疫苗免疫與血清抗體檢測試驗(yàn)。本試驗(yàn)的完成不僅可以了解賀州市不同地區(qū)三黃雞養(yǎng)殖場的H5及H7亞型禽流感抗體水平，還可以根據(jù)檢測結(jié)果，了解抗體消長規(guī)律，指導(dǎo)養(yǎng)殖場制定合理的免疫程序，為有效的防控禽流感的發(fā)生與流行提供參考依據(jù)。

一、材料與方法

1.試驗(yàn)雞群。在賀州市選擇4家飼養(yǎng)水平良好的三黃雞規(guī)模化養(yǎng)殖場，分別標(biāo)記為A場、B場、C場、D場，全部采用全進(jìn)全出養(yǎng)殖模式，養(yǎng)殖規(guī)模為9000-27000只。

2.試驗(yàn)疫苗。重組禽流感病毒(H5+H7)二價(jià)滅活疫苗，簡稱（H5+H7）二價(jià)滅活苗（下同），為國內(nèi)某廠家生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào)為：2017103。

3.檢測試劑。禽流感H5亞型、H7亞型血凝抑制（HI）試驗(yàn)抗原及標(biāo)準(zhǔn)陽性血清購自哈爾濱維科生物技術(shù)有限責(zé)任公司。雞紅細(xì)胞混懸液（1%）及磷酸鹽緩沖液（PBS）由本實(shí)驗(yàn)室自行配制。

4.試驗(yàn)分組與采樣。A、B、C、D四家養(yǎng)殖場雞只均在60日齡時(shí)進(jìn)行第一次免疫，一免后第21 d進(jìn)行第二次免疫，兩次免疫的免疫劑量均為0.5 ml/羽，采取頸部皮下注射進(jìn)行免疫接種。各場分別在免疫后第0 d、第15 d、第30 d、第45 d、第60 d隨機(jī)選擇60只雞，翅靜脈采血2 ml/羽，分離血清后-20℃保存，統(tǒng)一檢測。

5.抗體測定。檢測方法及結(jié)果判定參照GB/T18936-2003高致病性禽流感診斷技術(shù)進(jìn)行。

二、結(jié)果與分析

1.H5亞型血清抗體檢測結(jié)果。1500份血清樣品的H5亞型血清抗體檢測結(jié)果見表1和圖1。結(jié)果表明：該疫苗免疫三黃雞后，可較好的刺激機(jī)體產(chǎn)生H5 HI抗體，且四個(gè)場的HI抗體消長規(guī)律基本一致，其平均抗體水平均呈現(xiàn)隨日齡增加先上升后下降再平穩(wěn)回升的明顯變化。一免后H5 HI抗體迅速上升，在一免后第15 d時(shí)，四個(gè)場的抗體均可達(dá)到平均抗體滴度5.0 log2以上的合格水平。加強(qiáng)免疫后（一免后第21 d），H5 HI抗體迅速升高，該疫苗在加強(qiáng)免疫后第9 d（一免后第30 d）H5 HI抗體水平達(dá)到高峰，此時(shí)A、B、C、D四個(gè)場的H5 HI抗體滴度分別為9.27 log2、6.88 log2、8.15 log2、9.10 log2；到加強(qiáng)免疫后第39 d（一免后第60 d）H5 HI的抗體水平均保持在6.0 log2以上。此外，在一免后第15～60 d期間四個(gè)養(yǎng)殖場的抗體陽性率均高于80%。

表1 H5亞型血清抗體的檢測結(jié)果

圖1 不同日齡H5亞型血清抗體平均值的變化曲線

2.H7亞型血清抗體檢測結(jié)果。1500份血清樣品的H7亞型血清抗體檢測結(jié)果見表2和圖2。結(jié)果表明：該疫苗免疫三黃雞后，可較好的刺激機(jī)體產(chǎn)生H7 HI抗體，且四個(gè)場的HI抗體消長規(guī)律基本一致，其平均抗體水平均呈現(xiàn)隨日齡增加先上升后下降再平穩(wěn)回升的明顯變化。一免后H7 HI抗體迅速上升，在一免后第15 d時(shí)，四個(gè)場的平均抗體滴度最高可達(dá)到7.03 log2。加強(qiáng)免疫后（一免后第21 d），H7 HI抗體迅速升高，該疫苗在加強(qiáng)免疫后第9 d（一免后第30 d）H7 HI抗體水平達(dá)到高峰，此時(shí)A、B、C、D四個(gè)場的H7 HI抗體滴度分別為8.93 log2、6.22 log2、8.28 log2、9.20 log2；到加強(qiáng)免疫后第 39 d（一免后第60 d）H7 HI的抗體水平均保持在4.5 log2以上的合格水平。此外，在一免后第30～60 d期間四個(gè)養(yǎng)殖場的抗體陽性率均高于80%。

表2 H7亞型血清抗體的檢測結(jié)果

圖2 不同日齡H7亞型血清抗體平均值的變化曲線

三、小結(jié)與討論

1.禽流感H5亞型血清抗體消長規(guī)律。對(duì)檢測結(jié)果的分析表明，一免后第0 d H5抗體平均水平為0，說明在雞60日齡時(shí)母源抗體已經(jīng)消失。此時(shí)對(duì)幼雞進(jìn)行第一次免疫，21 d后進(jìn)行第二次免疫，注射疫苗后逐漸誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體。一免后第15 d抗體滴度快速上升，加強(qiáng)免疫后第9 d（一免后第30 d）抗體水平持續(xù)上升，但上升速率有所下降。第45 d抗體平均水平降至最低，說明一免產(chǎn)生的抗體水平開始下降，二免誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體上升速度不及下降速度。第60 d抗體水平已表現(xiàn)回升，說明二免后產(chǎn)生的抗體上升速度超過了一免產(chǎn)生的抗體的下降速度，家禽總體抗體水平升高，達(dá)到保護(hù)狀態(tài)。

從結(jié)果來看，一免后第15 d至肉雞出欄(第60 d)的時(shí)間段內(nèi)，家禽抗體滴度均達(dá)到合格標(biāo)準(zhǔn)，說明該免疫程序可有效抵抗禽流感H5亞型病毒的入侵。

2.禽流感H7亞型血清抗體消長規(guī)律。檢測結(jié)果顯示，一免后0 d時(shí)H7抗體平均水平為0，說明此時(shí)母源抗體已經(jīng)消失。此時(shí)對(duì)幼雞進(jìn)行第一次免疫，21 d后進(jìn)行第二次免疫，注射疫苗后逐漸誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體。第15 d抗體迅速升高，第30 d4個(gè)場的抗體水表現(xiàn)為持續(xù)快速上升，抗體平均滴度已經(jīng)達(dá)到6 log2以上，最高為9.2 log2的較高水平。加強(qiáng)免疫后第24 d（一免后第45 d）抗體水平下降至最低，可見二免產(chǎn)生的抗體上升速度還未及一免后產(chǎn)生的抗體下降的速度。第60 d B、C、D場均表現(xiàn)為回升，表明一免產(chǎn)生的抗體持續(xù)下降，二免后產(chǎn)生的抗體逐漸上升至較高水平，可使機(jī)體繼續(xù)保持較高的抗體效價(jià)，產(chǎn)生有效的抗體保護(hù)。

3.H5+H7二價(jià)滅活疫苗的免疫探討。

（1）免疫方案的分析。使用該疫苗一免后第15 d時(shí)機(jī)體H5、H7抗體水平均明顯上升，第15～30 d時(shí)抗體上升緩慢，第30 d（90日齡）后抗體開始下降。若沒有進(jìn)行第二次免疫，抗體水平持續(xù)下降，在出欄前（120日齡）出現(xiàn)疫情的幾率和風(fēng)險(xiǎn)較高。二免后，機(jī)體第二次誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體逐漸升高，使得抗體水平停止下降甚至有所升高，在出欄前得到有效的抗體保護(hù)。因此，對(duì)肉雞進(jìn)行禽流感二次免疫是必要的；

（2）疫苗的應(yīng)用推廣。此疫苗在三黃雞中對(duì)H5、H7均可產(chǎn)生較高的抗體水平，證明免疫效果確實(shí)。禽流感病毒既在家養(yǎng)禽類和野生禽類之間相互傳播，又隨候鳥遷徙，將病毒帶到世界各個(gè)角落。對(duì)于這種傳播迅速的疫情，H5+H7二價(jià)滅活疫苗應(yīng)列入強(qiáng)制免疫計(jì)劃，由試點(diǎn)到全國應(yīng)用，加強(qiáng)商品禽和種禽的免疫，切實(shí)做好生物安全防護(hù)等多方面的防控工作。

（3） H5+H7二價(jià)滅活疫苗的優(yōu)點(diǎn)。重組禽流感病毒(H5+H7)二價(jià)滅活苗屬于全病毒滅活疫苗，具有制備工藝簡單，免疫效果及安全性好、免疫持續(xù)時(shí)間長且不會(huì)出現(xiàn)毒力返強(qiáng)和變異的優(yōu)點(diǎn)。選擇二價(jià)苗可以減少免疫次數(shù)，提高免疫效率；

（4）存在問題。試驗(yàn)免疫程序首免日齡選擇在60日齡，此時(shí)雞只體內(nèi)H5及H7抗體均為零。而本試驗(yàn)未了解幼雞母源抗體的變化，在幼雞母源抗體最低值時(shí)到進(jìn)行第一次免疫后產(chǎn)生合格抗體水平的時(shí)間段內(nèi)是否處于保護(hù)狀態(tài)未知，因此免疫程序還有待優(yōu)化。同樣在不同的地域，品種不一致的情況下，合理的選擇首免日齡，免疫劑量，免疫方案都是值得研究探討的內(nèi)容。

參考文獻(xiàn)（略）