清香型白酒發酵過程中微生物種群空間分布

王雪山，杜海，徐巖*

1(江南大學 生物工程學院，工業生物技術教育部重點實驗室，釀酒科學與酶技術中心，江蘇 無錫，214122) 2(宿遷市江南大學產業技術研究院，江蘇 宿遷，223814)

白酒是我國傳統蒸餾酒，釀造歷史悠久，其以酒曲(大曲、小曲或麩曲)為糖化發酵劑，將糧谷原料(高梁、大米、糯米、玉米等)通過邊糖化邊發酵的雙邊固態發酵后，通過固態蒸餾、貯存勾兌，最終形成含有上千種微量組分的蒸餾酒[1]。由于固態發酵時酒醅物料的異質性，酒醅內部存在著復雜的固-液、氣-液、固-氣等多種界面，促使不同位置酒醅內形成了豐富的微生物種群多樣性及代謝特征多樣性[2]。

由于白酒固態發酵過程中微生物分布的不均一性對白酒品質具有影響，國內開展了大量針對白酒釀造微生物空間分布的研究。如陳林等結合微生物培養和變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)等技術分析醬香窖池中不同層次酒醅微生物組成，認為不同層次酒醅中霉菌、細菌、酵母組成各不相同[3]。胡峰等結合微生物分離培養技術與風味分析手段分析不同層次醬香型白酒酒醅，認為上層酒醅的細菌、霉菌和酵母含量均高于中、下層酒醅，且微生物含量的差異造成了不同層次白酒風味特征的差異[4]。吳衍庸等利用傳統培養技術分析不同位置窖泥中細菌種群結構，結果表明窖泥中己酸菌和甲烷菌含量隨窖池上、中、下位置順序遞增[5]。然而傳統的可培養方法及PCR-DGGE等分子方法費時費力，且對微生物種群結構的認識較有局限性。隨著測序技術的進步，高通量測序手段的應用進一步推動了對白酒釀造微生物的研究。如WANG等通過焦磷酸測序技術分析不同年份、不同位置窖泥的細菌種群結構，結果表明窖泥從上到下芽孢桿菌屬和梭菌屬含量逐漸上升，而乳桿菌屬含量逐漸下降[6]。

清香型白酒是中國白酒四大主要香型之一，目前國內對清香型白酒釀造微生態的研究多數是針對發酵過程中酒醅微生物種群演替的研究。如韓莎等通過可培養技術分析汾酒釀造過程中微生物群落結構，并找出微生物種群與代謝物之間的關系[7]。LI等基于核糖體高通量測序分析汾酒發酵過程中的微生物，認為汾酒發酵過程中主要細菌主要是乳桿菌科，真菌主要是酵母科和復膜孢酵母科[8]。僅有雷振河通過高通量測序手段分析清香型白酒地缸中心與邊緣位置酒醅微生物種群結構差異[9]。然而其研究缺少針對上、中、下位置酒醅的分析，而且其僅分析發酵10 d的酒醅，缺乏對不同位置酒醅整個釀造過程微生物演替規律差異的解析。

本研究以清香型白酒發酵過程中酒醅為對象，通過高通量測序技術解析不同位置酒醅中微生物種群組成及結構差異，有助于提升白酒釀造可控性及白酒品質穩定性。

1 材料與方法

1.1 酒醅樣品采集

樣品采集自某清香型白酒發酵過程中0、4、8、15和27天酒醅。每個時間點(0天除外)分別采集酒醅面層(上)、面層往下約50 cm處(中)及底層(下)3個層次的酒醅樣品。清香型白酒地缸中心位置與邊緣位置微生物種群結構存在差異[9]。因此本研究樣品采集時，每個層次采集中間和邊緣位置混合作為一個樣品以表征每一層次酒醅的綜合情況，以此研究上、中、下不同空間位置酒醅發酵過程中微生物種群演替差異。每份樣品采集500 g，于-80 ℃保存備用。

1.2 酒醅理化指標檢測

酒醅基本理化指標檢測方法參考文獻[10]，大致流程如下：

(1)溫度測定：樣品采集同時將溫度計插入取樣點附近，保持1 min左右，至溫度計讀數穩定后，記錄溫度數據。

(2)pH測定：稱取10 g酒醅加入裝有50 mL超純水的三角瓶中，充分振蕩搖勻后，用pH計直接檢測。

(3)含水量測定：稱取10 g酒醅樣品，于105℃烘箱中烘干4 h，根據酒醅烘干前后的重量計算酒醅的含水量。

(4)酒醅乙醇含量測定：乙醇含量的檢測參考WU等報道的方法[11]，乙醇定量采用外標法，標準曲線為：y=0.000 04x-0.041 9，R2=1.000 0，x為峰面積，y為乙醇質量濃度(g/L)。

1.3 樣品宏基因組提取

基因組提取采用間接提取法，首先通過0.1 mol/L PBS緩沖液(0.057 7 mol/L Na2HP04，0.042 3 mol/L NaH2PO4)收集菌體[12]。然后通過Omega EZNATM土壤基因組提取試劑盒完成基因組提取，步驟參考操作說明書。

1.4 PCR擴增及Illumina Miseq測序

通過細菌16S rRNA基因V3-V4可變區研究細菌種群結構，以F338(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和R806(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)為引物對酒醅基因組進行擴增[13]。擴增產物回收、定量后按照所需數據深度進行建庫，然后在Illumina Miseq平臺上進行2×300 bp雙端測序。通過真菌內轉錄間隔區(ITS)ITS2區研究真菌種群結構，以ITS3(5’-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)為引物對酒醅基因組進行擴增[14]。擴增產物回收、定量后按照所需數據深度進行文庫制備，然后在Illumina Miseq平臺上進行2×250 bp雙端測序。

1.5 高通量數據分析

數據下機后，通過Qiime(v1.8.0)進行原始數據處理[15]。根據序列重疊區域序列拼接，根據Barcode將不同樣品序列進行歸類。去除序列中接頭、標簽及引物序列，通過split分析去除低質量序列(長度<150 bp、含有模糊堿基N、序列質量得分

2 結果與分析

2.1 不同位置酒醅發酵過程中理化指標差異

酒醅發酵理化指標對分析酒醅發酵狀態至關重要[21-23]。由圖1可知，不同位置酒醅發酵初始溫度為20.1 ℃，初始含水量為47.63%，初始pH為6.0，符合正常發酵工藝參數[8, 24]。另外，發酵4 d時，酒醅溫度達到頂點，說明此時酒醅中微生物代謝速率最快，隨后微生物代謝逐漸減緩。發酵27 d時酒醅溫度僅16.6～17.0 ℃，說明此時發酵基本結束。不同位置酒醅在發酵過程中溫度、含水量及pH變化規律基本一致，然而乙醇代謝有較大差異。下層酒醅發酵4 d時，乙醇含量達到頂點86.84 g/kg酒醅，發酵8 d時降低，然后發酵結束時含量為60.15 g/kg酒醅。中層酒醅發酵8 d時乙醇產量達到頂峰91.67 g/kg酒醅，隨后含量下降至40.00 g/kg酒醅。然而上層酒醅發酵15 d時乙醇產量才達到頂峰65.42 g/kg酒醅。這表明上層酒醅乙醇產生速率低于中、下層酒醅。

圖1 酒醅發酵過程中理化指標變化規律Fig.1 Changes of physicochemical indexes in fermented grains during fermentation

2.2 不同位置酒醅發酵過程中微生物多樣性差異

通過基于Miseq平臺的擴增子測序技術，共檢測13個酒醅樣品。稀釋曲線是表征樣品測序結果是否能夠反映樣品實際生物信息的分析方式[25-26]。本研究稀釋曲線分析表明所有樣品細菌16S rRNA基因和真菌ITS基因測序都達到或接近平臺期，說明本次測序可覆蓋樣本中絕大多數微生物種群信息(圖2)。

圖2 酒醅發酵過程中細菌(A)和真菌(B)測序稀釋曲線Fig.2 Rarefaction curves of bacterial (A) and fungal (B) community in fermented grains during fermentation(注：0、4、8、15、27為發酵時間(天)；T、M、B為上、中、下位置酒醅。)

本研究通過Shannon指數和物種數目(observed species)表征樣品微生物α多樣性[27]。結果表明酒醅發酵前15 d，不同層次酒醅細菌種群多樣性均高于真菌種群多樣性，這一點與以往研究結論一致[8-9]。發酵0～4 d時，不同層次酒醅細菌多樣性均呈現下降趨勢，發酵4～8 d時上層酒醅細菌多樣性高于中層和下層酒醅。上層酒醅細菌種群多樣性高于中、下層的現象在胡峰等對醬香型白酒的研究中同樣有過報道[4]。這個現象與圖1-D中酒醅乙醇濃度變化規律相符，發酵4～8 d時中、下層酒醅乙醇濃度高于上層酒醅，而酒醅中高濃度的乙醇會抑制酒醅中不耐醇的微生物生長，造成中、下層酒醅中細菌多樣性低于上層酒醅。隨著發酵進行，發酵15 d之后，上、中、下3個層次酒醅細菌種群多樣性全部降低(圖3-A和B)，這可能是發酵后期酒醅中高醇、高酸的環境抑制了酒醅中大部分細菌種群的生長。然而真菌多樣性在發酵0～8 d時呈現先上升后下降的趨勢，不同層次酒醅真菌多樣性差別沒有明顯規律(圖3-C和D)。

圖3 酒醅發酵過程中細菌(A、B)和真菌(C、D)多樣性分析Fig.3 Diversity of bacterial (A, B) and fungal (C, D) community in fermented grains during fermentation

2.3 不同位置酒醅微生物種群結構差異

高通量測序顯示所有酒醅中的細菌種群可歸屬于17個門，其中平均相對豐度>0.1%的僅有厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)及藍細菌門(Cyanobacteria)。所有酒醅中的真菌種群可歸屬于7個門，分別為子囊菌門(Ascomycota)、接合菌門(Zygomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)、芽枝霉門(Blastocladiomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)及球囊霉門(圖4)。

圖4 酒醅發酵過程中細菌和真菌種群結構(門水平)Fig.4 Bacterial and fungal community structure in fermented grains during fermentation (at phylum level)

然而，圖4表明門水平酒醅細菌及真菌種群在空間位置上沒有明顯差異，僅存在演替變化。發酵開始時期，厚壁菌門(相對豐度52.75%)和變形菌門(46.02%)在酒醅中占主導地位。LI等通過焦磷酸測序分析汾酒酒醅發酵過程中同樣認為這兩個門是酒醅中主要的細菌種群[8]。同時，這兩個門的微生物同樣是濃香[10, 28-29]、醬香[30]及芝麻香[29]白酒發酵過程中的主要細菌種群，說明這些細菌種群是中國白酒發酵過程中的關鍵微生物。此外，圖4表明發酵4 d之后，酒醅中厚壁菌門(91.73%～99.58%)占絕對主導地位，這種現象與其他香型白酒相關研究都是一致的[8, 10, 28-30]。這個現象表明，白酒發酵過程中由多菌種演替為單一的厚壁菌門為主導的發酵模式是白酒固態發酵的典型模式。

真菌種群中子囊菌門在所有酒醅中占主導地位(相對豐度89.04%～98.72%)(圖4)。接合菌門僅發酵0天時豐度較高(9.99%)，發酵4天之后豐度逐漸降低。以往研究表明，子囊菌門不僅是清香型酒醅中優勢真菌種群[8]，同樣也是濃香[31]、醬香型白酒[11]及食醋[32]、面包[33]等多種發酵食品中的主要真菌種群。

屬水平共檢測到161個細菌屬，其中僅18個屬在所有樣品中都能檢測到(圖5)。酒醅中優勢細菌屬(平均相對豐度>1%)為7個，包括乳桿菌屬(Lactobacillus)、魏斯氏菌屬(Weissella)、Kroppenstedtia、假單胞菌屬(Pseudomonas)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、芽孢桿菌屬(Bacillus)及片球菌屬(Pediococcus)。發酵開始時(0天)，酒醅中假單胞菌屬相對豐度最高(25.00%)，其次是Kroppenstedtia(16.29%)、乳桿菌屬(11.61%)、魏斯氏菌屬(8.03%)、芽孢桿菌屬(6.50%)及片球菌屬(4.95%)。假單胞菌屬一般情況屬于條件致病菌，一般僅在大曲和發酵初期酒醅中能檢測到，不利于白酒釀造[34]。芽孢菌屬則可以代謝蛋白酶、淀粉酶等多種水解酶類，同時可代謝產乙偶姻、4-甲基吡嗪等風味物質[35]。發酵4 d時，酒醅中假單胞菌屬、Kroppenstedtia及芽孢桿菌屬相對豐度均下降至低于1%，而乳桿菌屬、魏斯氏菌屬和明串珠菌屬相對豐度均上升。而乳桿菌屬、魏斯氏菌屬和明串珠菌屬可代謝產生乳酸、乙酸等有機酸類物質，是造成白酒發酵前4 d pH下降的主要原因(圖1-C)。酒醅中低的pH和高濃度的乙醇一方面可以抑制酒醅中假單胞菌屬等不耐酸的雜菌，另一方面乳酸、乙酸等物質也為白酒中風味物質提供合成前體[8, 28]。而隨著發酵繼續進行，酒醅中乳桿菌屬成為主要細菌種群，相對豐度為58.02%～90.08%，而魏斯氏菌屬及明串珠菌屬在發酵15 d后相對豐度降至低于1%。魏斯氏菌屬及明串珠菌屬均屬于明串珠菌科細菌，雷振河關于汾酒酒醅微生物種群分析中同樣表明明串珠菌科細菌是發酵10 d酒醅時的優勢細菌種群(相對豐度5.5%～8.6%)[9]。然而LI等在夏季汾酒酒醅的研究中表明，明串珠菌科細菌豐度<1%，發酵5 d后酒醅中細菌種群已經演替為乳桿菌科為主導菌群的細菌種群結構[8]。產生這種差異的原因可能是取樣季節不同，本研究取樣季節為冬季，而不同季節對酒醅中微生物種群結構有較大影響。但是以上研究也都表明，即使發酵前期不同酒醅細菌種群結構有一定差異，然而發酵后期酒醅中優勢細菌種群都是乳桿菌屬。

圖5 酒醅發酵過程中細菌和真菌種群結構(屬水平)Fig.5 Bacterial and fungal community structure in fermented grains during fermentation (at genus level)

真菌ITS測序同樣檢測到161個真菌屬，其中34個屬在所有樣品中都能檢測到(圖5)。酒醅中優勢真菌屬(平均相對豐度>1%)為5個，包括畢赤酵母屬(Pichia)、假絲酵母屬(Candida)、曲霉屬(Aspergillus)、復膜酵母屬(Saccharomycopsis)和Kazachstania。而以往研究中[37]認為對清香型白酒釀造比較重要的酵母屬(Saccharomyces)和維克漢姆酵母屬(Wickerhamomyces)平均相對豐度僅為0.76%和0.19%。發酵開始時酒醅中畢赤酵母屬豐度最高(32.96%)，其次是復膜酵母屬(27.53%)、假絲酵母屬(19.53%)、曲霉屬(4.00%)和Kazachstania(1.85%)。以往研究同樣表明假絲酵母屬和畢赤酵母屬清香型白酒發酵過程中的優勢種群，同時也是清香型白酒中代謝產乙醇和產酯的主要功能微生物[9]。曲霉屬和復膜酵母屬代謝產生多種蛋白酶、水解酶類[36]，其中復膜酵母屬在夏季汾酒酒醅中同樣是優勢種群[8]。發酵4 d之后，酒醅中低的pH和高濃度的乙醇使酒醅中曲霉屬及復膜酵母屬相對豐度降低，而假絲酵母屬與Kazachstania相對豐度升高。發酵終點(27 d)時，曲霉屬相對豐度降低至0.67%～1.83%，復膜酵母屬相對豐度降低至2.19%～3.21%，而酒醅中耐醇耐酸的畢赤酵母屬(11.08%～18.60%)和假絲酵母屬(67.79%～74.13%)成為酒醅中優勢真菌種群。此外，酒醅中Kazachstania相對豐度發酵8 d時升至最高(11.41%～21.89%)，隨后降低至2.06%～3.53%。本研究中假絲酵母相對豐度與雷振河關于汾酒酒醅研究比較接近[9]，顯著高于LI研究中報道的豐度[8]，這進一步說明不同季節對酒醅中細菌、真菌種群結構都有較大影響。

同時從圖5可看出，發酵4～8 d時上層酒醅細菌和真菌種群結構與中、下層都有較大差異。其中上層酒醅中魏斯氏菌屬和畢赤酵母屬相對豐度均低于中、下層酒醅，而乳桿菌屬和Kazachstania相對豐度均高于中、下層酒醅。魏斯氏菌屬屬于異型發酵乳酸菌，可以代謝產生D型乳酸、乙酸、乙醇等[38]，畢赤酵母屬可以代謝產生乙醇、多種酯類和芳香族化合物[8, 37]。因此不同層次酒醅中的微生物種群結構差異勢必會造成不同層次酒醅風味代謝的差異。

2.4 不同位置酒醅發酵過程中微生物種群演替規律差異

本研究通過PCA分析進一步說明不同層次酒醅之間微生物演替差異，結果顯示不同層次酒醅細菌(圖6-A)和真菌(圖6-B)種群演替都存在一定差異。圖6-A顯示，發酵4～15 d時，上層酒醅細菌種群與中、下層都存在明顯差異，中、下層酒醅細菌種群演替規律較接近。上層酒醅發酵15 d時，其細菌種群與中、下層酒醅發酵8 d的比較接近，這表明上層酒醅發酵速率要慢于中、下層酒醅。而不同層次酒醅真菌種群也呈現類似的規律，即上層酒醅真菌種群與中、下層有較大差異。同時，圖6顯示發酵結束時不同層次酒醅細菌、真菌種群趨于一致，這也解釋了清香型白酒發酵27 d左右的合理性。這種現象與酒醅中乙醇產生速率相吻合，同樣是上層酒醅乙醇產生速率低于中、下層酒醅。這表明不同層次酒醅微生物種群結構及演替差異會對酒醅中物質代謝產生較大影響。

圖6 酒醅細菌(A)和真菌(B)種群主成分分析Fig.6 Principal component analysis (PCA) of bacterial(A) and fungal (B) community in fermented grains[注：0、4、8、15、27為發酵時間(d)；T、M、B為上、中、下位置酒醅]

3 結論

本研究利用高通量測序技術分析不同層次清香型白酒酒醅中微生物種群結構及演替規律，共檢測到161個細菌屬和161個真菌屬，其中乳桿菌屬、畢赤酵母屬和假絲酵母屬是酒醅中的絕對優勢微生物。不同層次酒醅微生物多樣性變化規律不同，而且微生物種群結構及演替規律存在明顯差異，微生物種群演替差異最終影響到酒醅中乙醇代謝的效率。

由于酒醅固態發酵過程中微生物分布不均一性較強，通過高通量測序技術高效的解析不同層次酒醅中微生物種群結構對判斷酒醅發酵階段有重要價值。然而本研究僅針對酒醅微生物種群結構差異分析，后續需要進一步結合代謝組學方法分析不同層次微生物結構差異對酒醅風味代謝的影響。