郫縣豆瓣后發酵過程中細菌群落與呈香物質相關性研究

徐煒楨,趙紅宇,楊懿,葉玉矯,岳鵬,張良*

1(西華大學 食品與生物工程學院，食品生物技術四川省高校重點實驗室，四川 成都,610039) 2(四川省丹丹郫縣豆瓣集團股份有限公司，國家企業技術中心，四川省豆瓣釀制工程實驗室，食品用酶生物發酵技術國家地方聯合工程研究中心，四川 成都,611732)

郫縣豆瓣屬中國傳統發酵食品，迄今為止已有300多年的歷史，被列為中國非物質文化遺產。郫縣豆瓣不僅生產工藝獨特，也以其味辣香醇、黏稠絨實、紅棕油亮、醬香濃郁等特點在我國醬類產品中獨樹一幟，堪稱川菜之魂[1-2]。截止2015年，“郫縣豆瓣”品牌價值已達607.16億元，位列“加工食品類地理標志產品”全國第一；當年產品總產量達到110萬t，實現工業產值102億元，出口世界絕大部分國家和地區，創匯超過4 000萬美元[3]。

郫縣豆瓣的生產包括前期發酵和后熟發酵2個階段，前期發酵主要是指蠶豆霉瓣子的制曲和辣椒坯的預處理[2]。后熟發酵主要是將成熟霉瓣子和成熟辣椒坯按比例配料混合，加入適量食鹽和水，進入發酵池發酵，經過一定時期的翻曬和陳化，即是郫縣豆瓣特有的日曬夜露工藝[4-5]。因此，郫縣豆瓣的生產過程可以表述為：郫縣豆瓣的生產是以蠶豆瓣制曲、辣椒坯和環境微生物等復雜的物質能量代謝過程為前提，通過獨特的“日曬夜露”開發發酵工藝，使得棲息在曲藥、辣椒坯、環境中的龐大微生物區系在發酵醅固、液、氣三相界面發生復雜的物質轉換、能量代謝和信息傳遞作用，并最終形成郫縣豆瓣獨特的成分構成和風味特征。

細菌在郫縣豆瓣發酵過程中發揮了非常重要的作用，其多樣性是特有的區域環境條件、霉瓣子制曲工藝、自然接種過程(“日曬夜露”工藝)與發酵坯高鹽含量(最低鹽含量大于15%)之間強烈選擇和協同進化的結果。另外，郫縣豆瓣以其醬香濃郁、味辣香醇等特點而聞名于世，其獨特的風味主要來源于發酵過程中微生物相對封閉的混合發酵過程所產生的各種呈香物質[5]。目前，國內已有眾多學者使用頂空固相微萃取氣質聯用(HS-SPME-GC-MS)[6]、同時蒸餾萃取氣質聯用(SDE-GC-MS)[7-8]、氣質聯用(GC-MS)[9-10]、電子鼻[11]等技術手段對郫縣豆瓣中呈香物質進行了檢測，各種檢測方法雖然在原理和結果等因素上有差異，但檢測的結果仍然有一定相似性，結果中均出現了3-甲基丁醇、糠醛、芳樟醇、乙酸乙酯以及四甲基吡嗪等物質。但是，國內外尚無將郫縣豆瓣后發酵期的細菌演替代謝過程與揮發性呈香物質的產生相關聯，探究細菌-香味相關性研究的報道。

本研究利用前期已發表的基于高通量測序的細菌群落變化的情況[12]，結合HS-SPME-GC-MS分析結果，擇取影響郫縣豆瓣后發酵過程中的“主體因子”，研究從穩定發酵(6個月)至發酵末期(5年)合計5個不同發酵階段的細菌群落特點和揮發性呈香物質特性，揭示郫縣豆瓣不同后發酵階段的細菌演替與揮發性呈香物質的相關性，以期為進一步加深對本土特色調味品發酵機制的認識，為傳統產業的現代化改造和食品質量安全控制提供科學支撐。

1 實驗材料與方法

1.1 樣品采集

郫縣豆瓣樣品取自四川省丹丹郫縣豆瓣集團股份有限公司生產車間。分別采取已進行后發酵6個月、1年、2年、3年及5年的豆瓣(分別編號為6M、1Y、2Y、3Y及5Y)。由于郫縣豆瓣在后發酵時，隔段時間需進行攪拌、翻曬，故取樣時從每個發酵池的上層(距表面0～20 cm)、中層(距表面30～50 cm)、下層(距池底0～20 cm)各取25 g左右，混合均勻后密封，低溫運至實驗室，于-70 ℃保存備用。總DNA提取和呈香物質分析需在2 d內完成。

1.2 實驗儀器與設備

SPME手動進樣手柄、75 m CAR/PDMS萃取頭:美國Supelco公司。QP2010plus氣相色譜質譜聯用儀:日本島津公司。

1.3 郫縣豆瓣后發酵期揮發性呈香物質的數據提取

(1)基于HS-SPME法的萃取操作。稱取5.0 g研磨后的樣品，放入15 mL密封頂空瓶中，置于55 ℃恒溫水浴循環槽中平衡20 min。然后將老化后的75 μm CAR/PDMS萃取頭插入頂空瓶中吸附30 min，隨后再插入氣相色譜儀進樣口，250 ℃解析5 min。

(2)GC-MS分析。氣相色譜條件：DB-5MS毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；載氣為氦氣，流速1 mL/min；進樣口溫度250 ℃；不分流進樣；升溫程序：起始溫度40 ℃，保持2 min，再以3 ℃/min升至160 ℃，隨后以6 ℃/min升至200 ℃，保留3 min，最后以10 ℃/min升至230 ℃，保持3 min。

質譜條件：電離方式為電子轟擊電離(electron impact ionization，EI)，離子源溫度230 ℃，接口溫度280 ℃，質量掃描范圍40～600m/z，溶劑延遲時間2 min，掃描模式為全掃描模式(Full Scan)。

揮發性物質的定性：主要采取譜庫檢索和保留指數兩種方法進行郫縣豆瓣樣品中揮發性物質的定性。①譜庫檢索：主要依據所檢測出物質的質譜信息與NIST11譜庫進行比較，根據相似度的高低進行取舍，一般大于80%時對該物質予以確認。②保留指數鑒定：以C8～C20的正構烷烴為標準，計算樣品中揮發性物質的保留指數，與其他文獻中相同物質的保留指數進行比較予以確認。

1.4 基于高通量測序的郫縣豆瓣后發酵期細菌群落數據提取

郫縣豆瓣后發酵期細菌群落數據的獲取方法，可參照文獻[12]，本研究選取屬水平平均相對豐度≥1%的細菌作為分析數據。

1.5 郫縣豆瓣后發酵期細菌群落與呈香物質相關性分析方法

本研究采用偏最小二乘回歸法(PLSR)，該方法是集多元線性回歸分析、典型相關分析、主成分分析于一體的新型多元統計數據分析方法，其主要研究多因變量對多自變量的回歸建模，特別當各變量內部高度線性相關時，較其他多元回歸分析方法更為有效[13]。

本研究使用UNSCRAMBLER軟件(9.7.1，CAMO Software)進行郫縣豆瓣中微生物群落與呈香物質的PLSR分析。使用軟件中PLS 2分析模型，驗證方法選取完全交叉驗證(Full-Cross Validation)；以微生物相對豐度數值作為自變量集X，以呈香物質作為因變量集Y，二者權重(Weights)均選擇“All 1.00/SDev”。

最后使用SPSS軟件(19.0.0，IBM)對核心菌群與重點呈香物質進行皮爾森相關系數分析，以側面印證PLSR分析結果。

2 結果與討論

2.1 郫縣豆瓣后發酵期揮發性呈香物質分析

結合已有研究[6-11]和本實驗結果，選取基本存在于郫縣豆瓣后發酵期全部5個樣品中的特征風味物質，且平均相對含量≥0.30%的呈香物質共計24種(n=24)開展后續分析，結果如表1所示。

表1 用于偏最小二乘回歸分析的郫縣豆瓣揮 發性呈香物質Table 1 Volatile compounds of Pixian soybean paste forPLSR

注：“—”表示未能找到相關風味描述。

從表1可以看出，郫縣豆瓣后發酵期主要的揮發性呈香物質為醇類(22.42%)、醛類(16.41%)、酯類(19.94%)、酚類(12.63%)和雜環類(2.43%)。醇類是構成郫縣豆瓣特征風味的一類重要化合物，通常呈現出令人愉快的香味及甜味，可以被氧化成醛類、酸類等，還是酯化反應的重要前體物質[14-15]。醛類通常呈現出令人滿意的甜香及花果香，較多地存在于糖果、水果及堅果中，被認為可以增強食品的風味品質[16]。酯類主要由醇類與酸類的酯化反應生成，酯類通常呈現出令人愉悅的甜香及果香，除此之外，酯類還可掩蓋游離脂肪酸帶來的不愉快氣味[17]。有研究表明，短鏈酯類通常具有較低的閾值(小于相應醇類近10倍)且在常溫條件下即可大量揮發，從而即使在濃度很低的條件下也能對食品的風味產生較大的影響[18-19]。乙酸乙酯和十二酸乙酯是郫縣豆瓣中相對含量最高的2種酯類，前者呈現出清香、果香及酒香；后者則因其風味閾值較高(大分子脂肪酸酯類)而提供風味上的厚重感[8]。酚類由于其易氧化的性質，在后發酵過程中會不斷被消耗，其含量應不斷減少。郫縣豆瓣較高相對平均含量的4-乙基愈創木酚(10.58%)，這可能是實際生產中“老”豆瓣醬香醇厚綿長而新豆瓣醬香濃郁突出的原因。雜環類物質主要在后發酵過程中由Maillard反應和Stretcher降解產生的氨基酮經縮合反應生成，這類物質在郫縣豆瓣中相對含量較低，但具有較低的風味閾值[17,20-21]，這些物質也是構成郫縣豆瓣揮發性呈香物質的重要組分。

2.2 基于高通量測序的郫縣豆瓣后發酵期發酵細菌數據選取

根據測序數據[12]，選取細菌屬水平平均相對豐度≥1%的樣品作為分析數據，合計共有14個屬(n=14)，具體如表2所示。

表2 用于偏最小二乘回歸分析的細菌屬水平數據Table 2 Sequencing data of bacteria at genus level for PLSR

注：“—”表示未檢出。

2.3 郫縣豆瓣后發酵期細菌群落與揮發性呈香物質相關性分析

PLSR分析載荷圖如圖1所示。由圖1可看出，大部分變量點均落在50%方差解釋橢圓與100%方差解釋橢圓之間，遠離中心，說明各變量均在所提取的主因子1(Factor 1)和主因子2(Factor 2)中得到了較好的解釋。

在載荷圖右側有8種呈香物質聚在一起，分別為異戊醛、2-甲基丁醛、5-甲基呋喃醛、苯甲醛、苯乙醛、5-甲基-2-苯基-2-己烯醛、2,6-二甲基吡嗪以及2-乙酰基吡咯，共計6種醛類和2種雜環類。8種呈香物質都靠近100%方差解釋橢圓的邊界，表明這8種物質所包含的變量信息在該模型下得到了較好的體現。

圖1 細菌群落與呈香物質的二維相關性載荷圖Fig.1 Correlation loading plots between bacterial taxa and volatile compounds注：由內到外的兩個橢圓分別表示所解釋的方差達到50%和100%。

結合研究數據表明(已另文發表)上述8種呈香物質均隨著豆瓣后發酵時間的延長而呈現相對含量上升的趨勢，說明Factor 1所代表的影響因素可能與時間有關。圖中靠近這8種物質的細菌屬類包括擬桿菌屬(Bacteroides)與奇古菌綱下暫定的氨氧化菌屬(CandidatusNitrososphaera)，這2個屬應該與上述8

種物質呈一定的正相關性；同時，注意到圖1左側邊界處的梭菌屬(Clostridium)、梭菌科下未確認菌屬(Clostridiaceae-Other)與消化鏈球菌科下未確認菌屬(Peptostreptococcaceae-Other)，3個細菌群類可能與上8種呈香物質呈現一定的負相關性。

同樣地，從圖1還可以看出，腸桿菌科下未確認菌屬(Enterobacteriaceae-Other)以及芽孢桿菌科下未確認菌屬(Bacillaceae-Other)應該與糠醇、4-乙基愈創木酚呈現出一定的正相關性；葡萄球菌屬(Staphylococcus)與乙醇、糠醇、十二酸乙酯呈現出一定的正相關性，乳桿菌屬(Lactobacillus)與乙醇、十二酸乙酯呈現出負相關性；芽孢桿菌屬(Bacillus)則與芳樟醇呈現出負相關性。

2.4 郫縣豆瓣后發酵期細菌群落與呈香物質的皮爾森相關系數分析

為進一步定量揭示核心細菌群落與重點呈香物質的皮爾森的關聯性，本文列出其相關性系數表，見表3。從表3中可以看出，細菌群落與呈香物質的相關性基本與PLSR分析中的相符合。

表3 細菌群落與呈香物質的皮爾森相關系數Table 3 Pearson′s correlation coefficients between bacteria taxa and volatile compounds

注：*表示具有顯著的相關性(p<0.05)；** 表示具有極顯著的相關性(p<0.01)。相關性不顯著的行和列已被去除。

由表3可以看出，CandidatusNitrososphaera與5-甲基呋喃醛呈現出顯著的相關性。由于皮爾森相關系數只能表征變量間的線性相關程度，圖1中CandidatusNitrososphaera與5-甲基呋喃醛(ad7)相距較遠，因此可以推斷該PLSR模型中主因子2(Factor 2)可能表征著非線性的相關度。CandidatusNitrososphaera指代了極具多樣性的上百種硝化自養類微生物，其中大部分菌種至今未有準確的生物學定位，代謝機理也不明確[22]。但有學者報道了一類CandidatusNitrososphaeragargensis，通過對其全基因組進行測序及分析，初步推斷了該菌具有合成全套參與三羧酸循環(tricarboxylic acid cycle，TCA)氧化反應酶系的基因；同時，該菌表現出極強的環境適應能力，與本研究中富集于較長后發酵期樣品中的情況相符[23]。

表3中還可以看出，Bacillus與芳樟醇呈現出顯著的負相關性，與圖1的情況相符。Bacillus中的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)以及解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)大量存在于醬香型白酒大曲中，通過參與糖酵解、TCA等代謝途徑賦予了白酒豐富的營養因子以及獨特的醬香風味[24-25]。PRIPDEEVECH[26]等使用枯草芽孢桿菌的上清液對烏龍茶葉進行了發酵處理，結果發現，初始干茶葉中大量存在的芳樟醇、脫氫芳樟醇和γ用松油烯含量在發酵2 h后大幅減少，而檸檬烯以及2-戊基呋喃的含量則明顯增加。這與本研究中，芽孢桿菌屬與芳樟醇相對含量呈現出顯著負相關性的結果相符合；各個后發酵階段的郫縣豆瓣中都檢測到了2-戊基呋喃，但其相對含量在較低的水平(平均0.12%)，可能是因為在跨度較長的發酵期內2-戊基呋喃被發酵環境中其他微生物作為前體物質而消耗掉。

同時，Staphylococcus與異戊醇、糠醇以及異戊酸乙酯呈現出顯著的相關性，與乙醇、十二酸乙酯呈現出極顯著的相關性。Staphylococcus被證明具有較高的耐鹽性，其屬內的嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)在乳制品加工業中通常作為發酵劑來使用[27-29]。LI[30]等人使用PCR-DGGE、HTS以及HS-SPME-GC-MS等方法研究了同一批次9個郫縣豆瓣樣品中的細菌群落與揮發性呈香物質，之后使用PLSR分析了兩者之間的相關性，在其結果的PLSR因子載荷圖上Staphylococcus也與糠醇聚在一起，表明兩者具有一定的相關性。值得注意的是，有學者[27]研究了資陽臨江寺豆瓣在制曲階段的理化指標、細菌群落和代謝產物，以及它們之間的相關性:Staphylococcus與臨江寺豆瓣的色度有顯著的相關性，與pH具有極顯著的相關性。Staphylococcus可能通過對發酵環境的改變而影響了其他微生物的代謝進程，并最終體現在呈香物質等微生物代謝產物的積累上。

除此之外，芽孢桿菌科下未確認菌屬(Bacillaceae-Other)以及腸桿菌科下未確認菌屬(Enterobacteriaceae-Other)都與糠醇呈現出顯著的相關性，同時都與乙醛、異戊醛、2-甲基丁醛和苯甲醛呈現出顯著的負相關性；梭菌科下未確認菌屬(Clostridiaceae-Other)與5-甲基-2-苯基-2-己烯醛、2-乙酰基吡咯呈顯著的負相關性。這些均與圖1中所觀察到的結果相符合，但由于實驗技術的局限性，不能明確菌群詳細的屬群分類。

黃湛[31]等人使用GC-O等方法研究了郫縣豆瓣中特征呈香物質，最終確定了一級傳統郫縣豆瓣中特征呈香物質為異戊醛、2-甲基丁酸乙酯、異戊酸乙酯、3-甲硫基丙醛、苯乙醛、四甲基吡嗪、芳樟醇、苯乙醇、2-乙基苯酚和4-乙基愈創木酚。

本研究中，CandidatusNitrososphaera與5-甲基呋喃醛之間呈現出顯著相關性，但5-甲基呋喃醛在所測定豆瓣樣品中相對豐度較小(平均0.82%)，且風味閾值較高，不易被嗅覺感知[31]。因此，雖然CandidatusNitrososphaera表達出與呈香物質的相關性，但暫不將其列入對呈香物質產生重要影響的菌種。Bacillus及Staphylococcus分別顯示出與芳樟醇與異戊酸乙酯2種郫縣豆瓣特征呈香物質具有顯著的相關性，而且2個細菌屬在所測定的郫縣豆瓣樣品中都具有較高的相對豐度(平均>1%)，因此初步將其確定為影響郫縣豆瓣后發酵期呈香物質的重要菌種。

白酒與郫縣豆瓣同作為中國本土特色傳統發酵食品，歷經幾千年仍然長盛不衰。有學者[32]報道白酒中存在大量功能性成分，其中4-羥基-3-甲氧基肉桂酸、四甲基吡嗪等被發現天然存在于部分中藥材中；這些功能性成分賦予了白酒暢血通脈、活血祛瘀、健脾康胃等保健功效。在本研究中，一些功能性微量成分如乙酸、乳酸等有機酸，乙酸乙酯、乳酸乙酯等酯類化合物，愈創木酚、4-乙基愈創木酚等酚類化合物，芳樟醇、β-紫羅蘭酮等萜烯類化合物，2,6-二甲基吡嗪、四甲基吡嗪等吡嗪類化合物等被發現普遍存在于不同后發酵期郫縣豆瓣中，這為以后挖掘郫縣豆瓣的生物功能性提供一定思路。

誠然，相關性分析中只有少量成分顯示出與微生物菌群具有顯著相關性，但無疑所有這些功能性成分都受到發酵體系中微生物的影響，因為實驗技術或方法的局限性，未能得到全面合理的解釋。因此，積極探索先進的實驗方法，獲得更為詳盡的實驗數據，才能更全面地闡釋郫縣豆瓣后發酵機理，更好地推動郫縣豆瓣產業化、現代化進程，為郫縣豆瓣走出國門、享譽海外奠定堅實的科學基礎。

3 結論

使用PLSR分析了郫縣豆瓣中核心細菌群落與重點呈香物質的相關性，所提取的前2個主因子分別解釋了總體變異量的67%及69%，主因子1可能與后發酵時間有關，主因子2則表征非線性的相關程度。該回歸模型可以有效地分析多自變量與多因變量間的相關性。

PLSR分析結果顯示，Bacteroides、CandidatusNitrososphaera、Clostridium、Clostridiaceae-Other與Peptostreptococcaceae-Other可能與6種醛類和2種雜環類呈香物質具有一定的相關性；Enterobacteriaceae-Other以及Bacillaceae-Other與糠醇、4-乙基愈創木酚呈現出一定的相關性；Staphylococcus與乙醇、糠醇、十二酸乙酯呈現出一定的正相關性，Lactobacillus則與乙醇、十二酸乙酯呈現出負相關性；Bacillus則與芳樟醇呈現出負相關性。

結合皮爾森相關系數分析結果，可以確定Bacillus、Staphylococcus是影響郫縣豆瓣后發酵期呈香物質的重要菌種，可以作為下一步的重點關注研究方向。