三株植物乳桿菌對代謝綜合征大鼠腸道菌群的影響

朱廣素，王剛*，王園園，馬方勵(lì)，趙建新，張灝，陳衛(wèi)

1(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫，214122) 2(無限極(中國)有限公司，廣東 廣州，510623)

代謝綜合征作為流行性疾病在世界范圍內(nèi)爆發(fā)，主要癥狀包括高血糖、高血脂、高血壓、胰島素抵抗及肥胖等一系列代謝紊亂，而營養(yǎng)過剩是其主要發(fā)病原因之一[1-3]。近年來，大量研究表明，機(jī)體通過免疫-代謝-菌群之間的相互作用在高脂飲食引發(fā)的肥胖及代謝性疾病中發(fā)揮重要作用[4-6]。飲食、藥物、抗生素和免疫系統(tǒng)紊亂等因素導(dǎo)致的腸道內(nèi)有益菌減少同時(shí)可能導(dǎo)致炎癥的病原菌增加[7-9]，與代謝性疾病、心腦血管疾病及糖尿病等慢性病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4, 10-11]。益生菌具有調(diào)節(jié)腸道菌群失調(diào)、增強(qiáng)腸道免疫、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的作用，因此，通過膳食補(bǔ)充益生菌靶向調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)將成為緩解代謝綜合征的有效途徑[12-13]。

近年來，逐漸成熟的高通量測序技術(shù)，因其測序通量及準(zhǔn)確度較高，可對微生物群落中的物種組成及遺傳信息進(jìn)行相對定量分析[14-15]，成為深入分析腸道菌群的結(jié)構(gòu)和功能的重要工具[16-17]。本實(shí)驗(yàn)室前期對來自不同地區(qū)傳統(tǒng)泡菜中的植物乳桿菌進(jìn)行分離，通過體外篩選得到3株具有良好耐酸、耐膽鹽特性的菌株。本研究建立了高糖高脂飲食誘導(dǎo)的代謝綜合征大鼠模型，采用Miseq高通量測序技術(shù)，對益生菌干預(yù)后的大鼠腸道菌群的差異進(jìn)行分析，評價(jià)不同菌株對代謝紊亂大鼠腸道菌群多樣性和物種組成的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與設(shè)備

主要試劑：MRS培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司；高糖高脂飼料，北京華阜康生物技術(shù)有限公司；TaqDNA聚合酶，上海科晴生物科技有限公司；FastDNA Spin Kit for Soil細(xì)菌基因組提取試劑盒，MP bio；QIAquick Gel Extraction Kit膠回收試劑盒，QIAGEN；Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit，Life Technologies；KAPA Biosystems Library Quantification Kit，KAPA Biosystems；TruSeq DNA LT Sample Preparation Kit，Illumina；Miseq Reagent Kit，Illumina。

主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備：高速冷凍離心機(jī)，Eppendorf；大容量冷凍離心機(jī)，多功能酶標(biāo)儀，Thermo；快速核酸提取儀FastPrep-24，MP；SpectraMax M5酶標(biāo)儀，Molecular Devices；Agilent Bioanalyzer 2100，Agilent；Miseq測序儀，Illumina；CFX Connect Real-time System，Bio-Rad。

1.2 實(shí)驗(yàn)菌株

實(shí)驗(yàn)用菌株均來自于江南大學(xué)食品生物技術(shù)中心菌種保藏中心(CCFM)，鼠李糖乳桿菌LactobacillusrhamnosusGG(LGG)為對照菌株。菌株具體信息及來源見表1。

表1 菌株信息表Table 1 Strains information

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為SD雄性大鼠，購于上海斯萊克公司。適應(yīng)1周后，隨機(jī)分為8組。飼養(yǎng)條件為：4只一籠，同室飼養(yǎng)，自由飲食飲水；溫度為(22±2) ℃；濕度為(55±5)%；12 h光暗交替。

1.4 方法

1.4.1 菌懸液的制備

將菌株接種于MRS培養(yǎng)基中，37 ℃活化2代后用于制備動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所需菌懸液。將培養(yǎng)好的菌液以8 000×g離心20 min，無菌PBS緩沖液清洗菌體2遍，調(diào)整活菌數(shù)為5×1010CFU/mL，用質(zhì)量濃度為300 g/L的蔗糖溶液重懸后，于-80 ℃保藏備用。灌胃前用無菌水稀釋10倍。

1.4.2 動(dòng)物分組及處理?xiàng)l件

實(shí)驗(yàn)方案見表2。辛伐他汀和羅格列酮分別作為降血脂和降血糖的陽性對照。

表2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案Table 2 Protocol of animal experiment

1.4.3 大鼠糞便收集及細(xì)菌DNA的提取

參考MAO等[18]的研究在第12周實(shí)驗(yàn)結(jié)束前，收集大鼠糞便，按照FastDNA Spin Kit for Soil試劑盒的操作步驟提取大鼠糞便中細(xì)菌基因組。

1.4.4 細(xì)菌16S rDNA的擴(kuò)增

以細(xì)菌基因組為模板，擴(kuò)增16S rDNA的V3-V4區(qū)(上游引物341F: CCTAYGGGRBGCASCAG；下游引物806R: GGACTACNNGGGTATCTAAT；擴(kuò)增片段長度465 bp)，不同樣品用7個(gè)堿基組成的barcode進(jìn)行區(qū)分，加在上游引物341F的5’端。50 μL聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)反應(yīng)體系及條件見表3。

表3 PCR反應(yīng)體系及條件Table 3 Reaction system and conditions of PCR

PCR反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，電壓 120 V，約 30 min，凝膠成像儀拍照并記錄電泳結(jié)果。

1.4.5 擴(kuò)增產(chǎn)物的純化、定量及等質(zhì)量混樣

根據(jù)凝膠電泳結(jié)果，切膠，按照QIAquick Gel Extraction Kit試劑盒的操作步驟進(jìn)行PCR產(chǎn)物的回收；純化的DNA樣品按照Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit試劑盒的操作步驟，測定濃度(ng/μL)；根據(jù)定量結(jié)果，按照總體積為50 μL，等質(zhì)量濃度混合樣品。

1.4.6 文庫構(gòu)建及上機(jī)測序

按照TurSeq Nano DNA LT Sample Preparation Kit試劑盒的操作步驟構(gòu)建文庫，包括末端修復(fù)、純化去片段、3’端加A、接頭連接、PCR擴(kuò)增及純化；文庫構(gòu)建完成后，采用Agilent Bioanalyzer 2100測定DNA片段的大小；按照KAPA Biosystems Library Quantification Kit 試劑盒的操作步驟，qPCR法精確測定DNA的質(zhì)量濃度(ng/μL)；將構(gòu)建的文庫按照上機(jī)試劑盒的要求進(jìn)行前處理，用MiSeq測序儀上機(jī)測序。

1.4.7 下機(jī)數(shù)據(jù)處理

測序完成后，參照毛丙永[19]的方法，對下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。在QIIME平臺(tái)計(jì)算樣品的α-多樣性和β-多樣性

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用OriginPro 2017 和Graphpad Prism5進(jìn)行繪圖，使用SPSS 22.0對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。相同字母代表無顯著性差異，p<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠腸道菌群的多樣性

2.1.1 α-多樣性分析

通過Miseq高通量測序，59個(gè)糞便樣品共產(chǎn)生1 561 896條高質(zhì)量的16S rDNA序列，平均每個(gè)樣品26 473條；所有序列按照參考序列聚類，按照97%序列相似性劃分OTU，共產(chǎn)生498 218個(gè)OTU。

所有樣品的Chao1指數(shù)、Shannon 指數(shù)的結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明，NC對照組與HFHS模型組的α-多樣性分析無顯著差異。灌胃植物乳桿菌CCFM591顯著提高了Chao1指數(shù)，與RH藥物組和對照菌株LGG水平相當(dāng)，與測序的OTU結(jié)果相吻合。RH藥物組的Shannon指數(shù)最大，CCFM591和LGG組次之。

A-chaol指數(shù)；B-shannon指數(shù)圖1 植物乳桿菌對代謝綜合征大鼠α多樣性指數(shù)的影響Fig.1 Effects of L. plantarum on α diversity index in rats with metabolic syndrome

2.1.2 β-多樣性分析

基于UniFrac距離對樣品進(jìn)行非加權(quán)的主坐標(biāo)分析結(jié)果如圖2所示。從PCoA圖可以看出，NC對照組聚集在右上方，與其他組別完全分開；SC和RH藥物組、HFHS模型組與4株乳桿菌灌胃組分別聚集在左上、中和下方；表明不同的干預(yù)方式顯著改變了大鼠腸道菌群的結(jié)構(gòu)。

?-NC;●-HFHS;◆-SC;-RH;?-CCFM591;■-QS6-12;▲-ZS2058;▼-LGG；a-PCoA-PC1 vs PC2;b-PCoA-PC1 vs PC3圖2 基于UniFrac距離對樣品進(jìn)行非加權(quán)的主坐標(biāo)分析Fig.2 Principal coordinates ananlusis (PCoA) plots based on unweighted UniFrac metrics

PC1解釋了總變異的4.38%，將NC組與其他7組高糖高脂飲食組完全分開，表明PC1反映的是飲食影響因素；PC2解釋了總變異的3.23%，將藥物組、模型組和乳桿菌干預(yù)組完全分開，表明PC2反映的不同干預(yù)方式發(fā)揮的作用；PC3解釋了總變異的2.73%，乳桿菌干預(yù)組和NC組在PC3上比較接近，表明乳桿菌干預(yù)能使高糖高脂飲食導(dǎo)致的菌群紊亂趨于正常化；綜合PC1和PC3的聚類結(jié)果表明，LGG和ZS2058組大鼠的菌群結(jié)構(gòu)與正常組相似。

2.2 大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)

2.2.1 益生菌對大鼠腸道菌群門水平相對豐度的影響

采用16S rDNA技術(shù)分析大鼠糞便的菌群組成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在門水平(圖3)，大鼠腸道菌群主要由Firmicutes、Bacteroidetes、Actinobacteria和Proteobacteria組成，其中豐度最大的是Firmicutes和Bacteroidetes，平均相對豐度分別為82.94%和9.99%。

圖3 不同組別大鼠腸道菌群在門水平上的組成Fig.3 Composition of the gut microbiota in different groups of rats at the phylum level

與NC組相比，HFHS飲食使大鼠的腸道菌群發(fā)生了顯著變化，即Firmicutes和Proteobacteria豐度增加、Bacteroidetes和Actinobacteria豐度降低(圖4)，而CCFM591和LGG灌胃后能使菌群恢復(fù)到正常水平；同時(shí)，CCFM591和LGG處理也使Firmicutes/Bacteroidetes和Proteobacteria/Bacteroidetes的比值顯著降低(圖5)，與藥物RH的效果相當(dāng)。

2.2.2 益生菌對大鼠腸道菌群科水平相對豐度的影響

進(jìn)一步分析大鼠糞便的菌群組成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在科水平(圖6)，正常飲食的大鼠腸道菌群主要由Lactobacillaceae、S24-7、Ruminococcaceae、Clostridiaceae、Turicibacteraceae、 Corynebacteriaceae組成，而HFHS中，Lactobacillaceae、Lachnospiraceae和Clostridiales(未知科)的相對豐度顯著增加；灌胃乳桿菌能調(diào)整腸道菌群的結(jié)構(gòu)，同時(shí)使Bacteroidaceae豐度顯著增加，其中LGG處理組菌群組成最接近NC組，CCFM591次之。

與NC組相比，HFHS飲食導(dǎo)致Lachnospiraceae相對豐度的增加，S24-7、Turicibacteraceae 、Clostridiaceae的相對豐度降低(圖7)。CCFM591和QS6-12干預(yù)能夠顯著增加S24-7的相對豐度；ZS2058干預(yù)能夠提高Turicibacteraceae和Clostridiaceae的相對豐度。4株益生菌灌胃均能顯著降低Lachnospiraceae的相對豐度；各組別中Ruminococcaceae的相對豐度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖4 不同組別大鼠菌群主要門的相對豐度的變化Fig.4 Relative abundance of dominant phylum in different groups

圖5 不同組別大鼠菌群Firmicutes/Bacteroidetes(A)和Proteobacteria/Bacteroidetes(B)比值的變化Fig.5 Ratio of Firmicutes/Bacteroidetes (A) & Proteobacteria/Bacteroidetes (B) in different groups

圖6 不同組別大鼠腸道菌群在科水平上的組成Fig.6 Composition of the gut microbiota in different groups of rats at the family level

2.2.3 益生菌對大鼠腸道菌群屬水平相對豐度的影響

進(jìn)一步分析了大鼠腸道菌群在屬水平上的多樣性(圖8)，共檢測到260個(gè)屬。分析發(fā)現(xiàn)，NC組大鼠菌群主要由Lactobacillus、Turicibacter、未分類S24-7 、Bifidobacterium、Corynebacterium、Prevotella、Enterococ-cus組成，而HFHS組大鼠主要由Lactobacillus、未分類Clostridiales、未分類Lachnospiraceae和未分類S24-7組成；SC和RH藥物處理組Blautia相對豐度增加，乳桿菌干預(yù)使Bacteroides的豐度明顯升高；在屬水平上，LGG組的菌群組成最接近正常水平。

圖7 不同組別大鼠菌群特定科的相對豐度的變化Fig.7 Relative abundance of selected family in different groups

圖8 不同組別大鼠腸道菌群在屬水平上的組成Fig.8 Composition of the gut microbiota in different groupsof rats at the genus level

所有大鼠樣品屬水平分析發(fā)現(xiàn)，Bacteroidetes包含24個(gè)屬，Actinobacteria包含38個(gè)屬，Proteobacteria包含67個(gè)屬，而Firmicutes包含了113個(gè)屬，是大鼠腸道中絕對的優(yōu)勢菌群，圖9所示為隸屬于Firmicutes門的特定屬的相對豐度的變化。

與NC組相比，HFHS組使大鼠腸道中Turicibacter的含量下降，而Blautia、Coprococcus、Roseburia、[Ruminococcus]和Oscillospira的豐度顯著升高。ZS2058組大鼠腸道中Turicibacter的豐度較高，Oscillospira的豐度較低，與正常組接近；Dorea在RH和SC藥物組大鼠腸道中的相對含量明顯高于其他組別，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；Streptococcus在LGG組大鼠中的含量略高于其他組別，HFHS中豐度最低。益生菌干預(yù)顯著提高了大鼠腸道中Lactabacillus的相對豐度，同時(shí)降低了大鼠腸道中Blautia、Coprococcus、Roseburia和[Ruminococcus]的相對豐度。

圖9 不同組別大鼠Firmicutes主要屬的相對豐度的變化Fig.9 Relative abundance of dominant genus in Firmicutes in different groups

3 討論

營養(yǎng)吸收與消耗失衡會(huì)引發(fā)一系列的代謝紊亂，從而導(dǎo)致腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[20]。近年來，益生菌及益生元被作為膳食補(bǔ)充劑以緩解慢性炎癥，但其在調(diào)節(jié)飲食誘導(dǎo)的腸道菌群改變中發(fā)揮的具體作用仍不明確。本研究通過建立高糖高脂飲食大鼠模型，采用Miseq高通量測序技術(shù)，深入分析了同種不同株的植物乳桿菌對腸道菌群多樣性及其結(jié)構(gòu)組成的影響。

通過對下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)每個(gè)樣品的goods_coverage指數(shù)都接近于1，說明測序深度已經(jīng)基本覆蓋到樣品中所有的物種。Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)分別表示菌群豐度和多樣性，與前人的研究一致[21-22]，補(bǔ)充降糖藥物RH、植物乳桿菌CCFM591和鼠李糖乳桿菌LGG可顯著提高大鼠菌群的多樣性。WEST等[23]研究表明，外源補(bǔ)充益生菌能增加干酪乳桿菌的含量，但并不能顯著改變菌群結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步的PCoA分析發(fā)現(xiàn)，高脂飲食使菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著改變，而益生菌干預(yù)對大鼠腸道菌群結(jié)果組成有一定的調(diào)節(jié)作用，但并不完全恢復(fù)至與正常大鼠一致。

高糖高脂飲食會(huì)導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)，從而引發(fā)胰島素抵抗、肥胖和其他代謝性疾病。大量研究表明益生菌干預(yù)可以調(diào)節(jié)Firmicutes/Bacteroidetes和Proteobacteria/Bacteroidetes的比值改變腸道菌群的結(jié)構(gòu)[24-25]。WANG等[21]通過454焦磷酸測序的方法，發(fā)現(xiàn)益生菌干預(yù)增加了與代謝綜合征呈正相關(guān)的OTU；BI等[20]通過IL-17A缺失小鼠模型發(fā)現(xiàn)，高脂飲食會(huì)使Firmicutes/Bacteroidetes的比值增加；LIM等[26]發(fā)現(xiàn)B.adolescentisIM38可以通過降低Proteobacteria/Bacteroidetes的比值抑制脂多糖的產(chǎn)生，從而緩解高脂飲食引發(fā)的結(jié)腸炎。在門水平上對物種組成進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)Firmicutes和Bacteroidetes是大鼠腸道中的優(yōu)勢菌群，HFHS飲食使Firmicutes豐度增加、Bacteroidetes豐度降低；CCFM591和LGG處理降低了Firmicutes/Bacteroidetes和Proteobacteria/Bacteroidetes的比值。

進(jìn)一步在屬水平上分析不同樣品的物種組成，HFHS飲食大鼠在屬水平上腸道菌群的組成差異較大。與前人的研究一致，Lactobacillus和Turicibacter(均屬于Firmicutes)是正常大鼠腸道中的優(yōu)勢種屬。Turicibacter能夠產(chǎn)乳酸，是大鼠腸道中特有的豐度較高的種屬。與Turicibacter相關(guān)的報(bào)道仍較少，分離自急性闌尾炎病人血細(xì)胞的Turicibactersanguinis是少有的被系統(tǒng)性研究的種屬[27]；PRESLEY等[28]通過研究小鼠菌群與免疫系統(tǒng)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)Turicibacter與免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞具有潛在的聯(lián)系。本文研究表明，補(bǔ)充植物乳桿菌ZS2058能夠提高大鼠腸道中Turicibacter的含量。

Firmicutes不同種屬含量的改變與特定的飲食相關(guān)，低碳水化合物的減肥飲食使產(chǎn)丙酸的Firmicutes(主要是Roseburia)豐度下降[29-30]。結(jié)果顯示，高糖高脂飲食增加了大鼠腸道中Firmicutes的豐度，補(bǔ)充益生菌降低了大鼠腸道中Blautia、Coprococcus、Roseburia和[Ruminococcus]的相對豐度。然而大量研究表明益生菌可以通過產(chǎn)生短鏈脂肪酸緩解高脂飲食導(dǎo)致的代謝紊亂，因此還需在種水平上深入分析植物乳桿菌對高糖高脂大鼠腸道菌群的影響。

4 結(jié)論

采用高通量測序技術(shù)，對代謝綜合征大鼠糞便樣品進(jìn)行宏基因組分析發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌 CCFM591的干預(yù)顯著降低了Firmicutes/Bacteroidetes和Proteobacteria/Bacteroidetes的比值，并且提高了菌群豐度及多樣性；PCoA結(jié)果表明，灌胃植物乳桿菌可一定程度的改善菌群結(jié)構(gòu)，提高大鼠腸道中Lactabacillus的相對豐度，同時(shí)降低了Blautia、Coprococcus、Roseburia和[Ruminococcus]的相對豐度。