替代模板法制備花椒麻味物質分子印跡聚合物及其吸附性能研究

李耀, 何葉子, 陳曉龍,2,3, 闞建全,2,3*

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715) 2(重慶市農產品加工與貯藏重點實驗室，農業部農產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室(重慶)，重慶，400715) 3(中匈食品科學聯合研究中心，重慶，400715)

花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim)含有多種生理活性成分，如揮發油類、生物堿類和酰胺類物質，目前從花椒中分離純化得到的酰胺類物質主要是山椒素及其羥基山椒素(見圖1)，這類酰胺物質被稱為花椒麻味物質，山椒素是最能代表花椒引起麻刺感的成分，花椒麻味物質具有麻醉、興奮、抑菌、祛風除濕、殺蟲和鎮痛等功效，在食品醫藥、化妝品等方面具有良好的應用前景[1-2]。花椒麻味物質在空氣中易氧化，目前還沒有商品化的標準品，傳統分離純化方法存在繁瑣、成本高等缺點，而花椒麻味物質的結構、性質、含量等方面還有待深入研究，因此迫切需要研究出花椒麻味物質更加高效的分離純化方法[3-4]。分子印跡技術為花椒麻味物質的分離純化提供了新的思路。在分子印跡技術中，采用與印跡分子結構相似的化合物作為替代模板分子(dummy template molecular)，可以解決一些印跡分子難獲得、溶解性差等問題[5-6]。用替代模板分子制備的分子印跡聚合物對目標印跡分子仍具有較好的印跡效果[7-8]。近些年替代模板分子印跡快速發展，但目前仍未見有關花椒麻味物質的替代模板分子印跡技術的報道。

現有花椒麻味物質標準品制備過程繁瑣、成本高，其分子鏈上的多個不飽和碳碳雙鍵容易發生共價鍵化學反應，使花椒麻味物質不易洗脫[9]；為解決上述問題，本實驗合成一種羥基山椒素的結構類似物LM2(見圖1-d)作為花椒麻味物質的分子印跡替代模板分子(理論分子質量為271)，采用本體聚合法制備了花椒麻味物質替代模板分子印跡聚合物(MIPs)，并對其吸附性能和分子識別能力進行了考察，以期為高純度花椒麻味物質的分離提取奠定基礎。

a-α-山椒素(R=H)和羥基-α-山椒素(R=OH);b-β-山椒素R=H和羥基-β-山椒素 R=OH;c-γ-山椒素 R=H及羥基-γ-山椒素 R=OH;d-替代模板的分子結構圖圖1 花椒麻味物質主要成分及替代模板的分子結構圖Fig.1 Structures of acid amide components identifiedin pepper and the molecular structure analogs ofsanshool acid amide components

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花椒麻味物質(HJMS)標準品(純度95%以上)，按照逆流干柱層析法、制備型HPLC法等工序制備[10]；鮮花椒，重慶凱揚農業有限公司；乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)、2-乙烯基吡啶(2-Vpy)均為分析純，阿拉丁公司；偶氮二異丁腈(AIBN)、氯仿、甲醇、冰乙酸、乙腈均為分析純，成都科隆試劑公司；1-氨基-2-甲基-2-丙醇、二異丙基乙基胺、1-羥基苯并三唑(HOBT)、月硅酸、異丁胺、1-H-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基鏻六氟磷酸鹽均為分析純，Sigma試劑公司；實驗用水為蒸餾水。

1.2 儀器與設備

DSHZ-300型水浴振蕩儀，蘇州市培英實驗設備有限公司；DHG-9123A 型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司；Eppendorf 5810型離心機，艾本德公司；超聲波清洗器，上海科導超聲儀器有限公司；HH-6型數顯恒溫水浴鍋，金壇市富華儀器有限公司；HPLC 1260型高效液相色譜儀，美國Agilent公司；CP214型電子天平，奧豪斯儀器上海有限公司；Equinox55傅里葉變換紅外光譜儀，德國Bruker公司；HITACHI S-3400N I型掃描電鏡，Hitachi Science Systems；R215旋轉蒸發器，BUCHI公司。

1.3 方法

1.3.1 花椒麻味物質結構類似物的合成方法[11]

取10 mmol月桂酸，于500 mL圓底燒瓶中，加入10 mmol的1-氨基-2-甲基-2-丙醇和20 mmol的二異丙基乙基胺，用60 mL無水DMF溶解后，于0 ℃冰浴下加入催化劑1-H-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基鏻六氟磷酸鹽(PyBOP)，30 ℃下攬拌反應24 h后，往混合液中加入200 mL水和100 mL乙酸乙酯稀釋，于500 mL分液漏斗中分層萃取，有機層用40 mL濃度為1 mol/L的NaOH和40 mL濃度為1 mol/L的HCl分別洗滌3次，再用40 mL的NaHCO3洗滌1次后用40 mL飽和NaCl洗滌，最后用無水硫酸鈉干燥1 h，傾倒出溶解有產物的乙酸乙酯溶液作為過硅膠柱層析的上樣液；薄層色譜點板以確定產物的層析位置，以乙酸乙酯/石油醚(V/V=1∶2)作為展開劑，濕法上樣，進行硅膠柱層析純化，根據薄層色譜點板的結果接收含有產物部分的過柱流出液，將含有產物的流出液旋蒸干，將結晶產物溶解在少量石油醚中重結晶，得到無色固體結晶，即為LM2。

1.3.2 花椒麻味物質結構類似物(LM2)的結構確證

核磁共振氫譜和碳譜檢測：取6 mg的結構類似物LM2于核磁管中，常溫下分別加入0.5 mL氘代氯仿(CDCl3)使之完全溶解，上超導核磁共振儀測定1H-NMR和13C-NMR圖譜，1H-NMR設置核磁兆數400 MHz，13C-NMR設置核磁兆數101 MHz。

氣相色譜質譜聯用檢測條件[10]：DB-5 ms毛細管柱，30 mm×0.25 mm；載氣氦氣，流速30 mL/min；進樣口溫度250 ℃；接樣口溫度280 ℃；柱溫80 ℃，升溫速度5℃/min；進樣量1 μL。倍增電壓：1 963 eV；離子源能量70 eV，發射電流2 mA；離子源溫度250 ℃。掃描速度0.82循環/s，掃描質量范圍(m/z)：35～500，標準圖庫NIST05。

1.3.3 花椒麻味物質的高效液相色譜(HPLC)檢測條件及標準曲線[12]

HPLC色譜檢測條件：色譜柱-Agilent EclipseXDB-C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)，流動相-甲醇∶水(體積比60∶40)，流速-1 mL/min，保留時間15 min，進樣量10 μL，柱溫40 ℃，紫外檢測波長254 nm。以高相液相色譜目標峰的平均面積(Y)對濃度(X，mg/mL)繪制標準曲線，花椒麻味物質標準曲線的線性回歸方程：Y=18 040X+265(R2=0.999)。

1.3.4 花椒麻味物質分子印跡聚合物的制備[13]

取67.75 mg(0.25 mmol)替代模板分子于50 mL燒瓶中，加入12 mL乙腈，1 mmol功能單體2-Vpy，充分溶解后，放置過夜；加入5 mmol交聯劑EDMA和10 mg引發劑AIBN，充分溶解后，向混合液中通氮氣20 min，使瓶內保持惰性氛圍，并在氮氣保護下用封口膜密封燒瓶；于50 ℃恒溫水浴鍋內熱引發聚合4 h后再于60℃恒溫水浴鍋內熱引發聚合20 h，得乳白色塊狀聚合物，將聚合物反復研磨，過200目標準檢驗篩；用丙酮自然沉降3次，每次1 h，棄去上層濁液，以除去聚合物中過細小的粒子；真空干燥處理沉淀物，以甲醇-乙酸(體積比9∶1)為洗脫液進行索氏提取，直至索氏提取器內溶液不含替代模板分子為止；用甲醇反復洗滌聚合物，將處理好的聚合物置于真空干燥箱內，50 ℃干燥至恒重，即制備了花椒麻味物質替代模板分子印跡聚合物(MIPs)。

空白印跡聚合物(NIPs)的制備及處理方法與MIPs相同，只是在聚合物合成過程中不加入替代模板分子[14]。

1.3.5 分子印跡聚合物的靜態吸附試驗

稱取50 mg替代模板分子印跡聚合物，置于20 mL具塞錐形瓶中，加入8 mL一定濃度的HJMS氯仿溶液，于振蕩器上25 ℃下150 r/min振蕩12 h后，倒入10 mL離心管中6 000 r/min離心5 min，高效液相色譜法測定上層清液中HJMS濃度，差減法計算該聚合物對HJMS的吸附量Q[15]，計算公式見式(1)，

Q=(C1-C0)V/M

(1)

其中：Q為MIPs的吸附容量,mg/g；C1為氯仿溶液中HJMS的原始濃度,μg/mL；C0為吸附后上層清液中HJMS的濃度,μg/mL；V為氯仿溶液的體積,mL；M為MIPs的重量,g。

1.3.6 MIPs和 NIPs的吸附動力學試驗

稱取50.0 mg MIPs和50.0mg NIPs，分置于20 mL具塞錐形瓶中，然后分別加入8 mL濃度為250 μg/mL的HJMS氯仿溶液，放入25 ℃恒溫振蕩器中(150 r/min)，每隔2、4、6、8、10、12、14 h取出MIPs和NIPs上清液各1份，測定其中HJMS濃度，繪制吸附容量Q(mg/g)與吸附時間t之間的變化曲線[16]。

1.3.7 MIPs和 NIPs的等溫吸附試驗

分別配制濃度為50、100、150、200、250、300 μg/mL的花椒麻味物質氯仿溶液。分別稱取多份50 mg MIPs和NIPs，分置于20 mL具塞錐形瓶中，按濃度梯度在每個容量瓶中加入8 mL上述溶液，于25℃恒溫振蕩器中振蕩12 h，取出，6 000 r/min離心5 min，高效液相色譜法測定上層清液中HJMS濃度，計算吸附容量、特異結合量、特異因子[17]。

特異結合量定義為式(2)：

ΔQ=QMIP-QNIP

(2)

特異因子定義為式(3)：

α=QMIP/QNIP

(3)

式中：α為特異因子；QMIP為MIPs的吸附容量；QNIP為NIPs的吸附容量。分子印跡研究中通常用QMIP表示吸附容量，特異因子α表示印跡效果。

用Scatchard模型評價MIPs的吸附特性，計算公式為式(4)：

Q/C=(Qmax-Q)/Kd

(4)

式中：Kd為結合位點的解離平衡常數；Qmax為結合位點的最大表觀結合量,mg/g；Q為MIPs對目標分子的吸附容量,mg/g；C為平衡時吸附液中目標分子的濃度,mg/mL[18]。

1.3.8 花椒麻味物質分子印跡聚合物的電鏡表征

稱取SMIP和SNIP粉末各100 mg，過200目篩后鍍金，于掃描電鏡下觀測樣品表觀形態[19]。

1.3.9 數據處理方法

每個實驗重復3次，用Origin 8.0和Excel 2003處理實驗數據并作圖，結果以“平均值±標準方差”來表示。

2 結果與分析

2.1 LM2 的氣相色譜-質譜聯用分析

由圖2可以看出，該花椒麻味物質的分子印跡替代模板分子LM2主要成分只有1個峰，按峰面積歸一化法進行積分計算，可估算出結構類似物LM2的相對百分含量在95%以上。通過分析主峰的離子質譜圖，發現LM2的加氫離子峰(M+H)的最大質荷比為272，減去氫質子即為271，按照分子式C16H33NO2計算的相對分子質量應為271，質譜圖顯示的最大質荷比與理論上計算出的相對分子質量相吻合[12]。

圖2 LM2的氣相色譜-質譜聯用圖譜Fig.2 Total ion current chromatogram and Massspectrogram peak of LM2

2.2 LM2 的核磁共振氫譜圖和碳譜圖分析

LM2(分子式C16H33NO2)的核磁解譜數據：1H-NMR (400 MHz, CDCl3):δ 6.06 (s, 1H), 3.26 (d,J=6.0 Hz, 2H), 2.75 (s, 2H), 2.20～2.24 (m, 2H), 1.86 (s, 1H), 1.68～1.60 (m, 2H), 1.38～1.30 (m, 6H), 1.26 (s, 8H), 1.22 (s, 6H), 0.88 (t,J=6.9 Hz, 3H)。13C-NMR (101 MHz, CDCl3):δ 174.4, 70.9, 50.3, 36.8, 31.9, 29.6, 29.5, 29.3, 29.3, 28.9,28.6,27.3, 25.9, 22.7, 14.1.

由圖3可知，氫原子的化學位移數可以與理論上對應的官能團吻合，經積分計算，氫原子有33個，與理論個數一致，碳譜上顯示碳原子均有15個，理論上LM2碳原子個數均為16，這是因為異丁基部分有兩個對稱的甲基碳的化學位移發生重疊，從核磁氫譜和核磁碳譜中看不出明顯雜質干擾，說明合成的LM2產物純度較高。

圖3 LM2的1H-NMR譜圖和13C-NMR譜圖Fig.3 1H-NMR and 13C-NMR spectrum of LM2

2.3 分子印跡聚合物的電鏡掃描表征

由圖4可知，MIPs與NIPs相比，立體效果更加明顯，表面有更多孔隙；MIPs具有良好的分散性，而NIPs表面看起來分散不均與，形狀不規則，有結塊現象發生。經比較可知，制備分子印跡聚合物過程中加入替代模板分子，對形成特異性吸附花椒麻味物質分子的空間結構有關鍵作用[20]。

圖4 MIPs(A)和 NIPs(B)的掃描電鏡圖(×10 000)Fig.4 The SEM photos of MIPs and NIPs(×10 000)

2.4 MIPs對花椒麻味物質的吸附動力學試驗

由圖5可知，MIPs和NIPs對HJMS的吸附容量均隨時間延長而增加，最后達到吸附平衡。MIPs和HJMS的接觸時間約10 h時就基本達到吸附平衡，達到吸附平衡后的吸附容量幾乎保持不變，MIPs對HJMS的吸附容量為(15.34±0.85) mg/g。這是因為MIPs表面存在結合位點，其內部也存在結合位點，而結合位點分布不均勻，剛開始吸附時，目標分子與表面結合位點快速結合，隨著表面結合位點的飽和，產生空間位阻，目標分子與內部結合位點逐漸緩慢結合，最終MIPs吸附目標分子達到飽和[21]。

圖5 MIPs及NIPs對花椒麻味物質的吸附動力學分析Fig.5 Binding dynamics of MIPs and NIPs to HJMS

2.5 MIPs對花椒麻味物質的等溫吸附試驗

由圖6可知，隨著底物HJMS的濃度增大，MIPs的吸附容量明顯增大，NIPs的吸附容量則增大緩慢。這說明MIPs對HJMS有較強的特異性結合能力，而空白印跡聚合物的這種能力很弱[22]，這是因為替代模板分子在MIPs中留下了對HJMS有特異識別性的空間結構及結合位點，而NIPs對HJMS的吸附作用主要是分子間作用力。實驗測定了花椒麻味物質在MIPs和NIPs上的結合等溫線，MIPs的擬合等溫吸附方程為y=1.363+66.127x-42.509 9x2，NIPs的擬合等溫吸附方程為y=1.357 2+29.836 4x-43.735 0x2，其中y表示吸附容量Q，x表示花椒麻味物質的初始濃度C，該擬合等溫吸附方程為研究MIPs對HJMS的特異性吸附能力、對其進行定量分析構建了理論模型。

圖6 MIPs和NIPs對花椒麻味物質的吸附等溫曲線Fig.6 The adsorption isotherms of MIPs and NIPs to HJMS

2.6 MIPs對花椒麻味物質的Scatchard模型分析

由圖7可知，MIPs吸附花椒麻味物質的Scatchard曲線，整體上呈非線性關系，可分為2段，2條斜率不同的直線均呈現良好的線性關系。在質量HJMS濃度為0.05～0.30 mg/mL時，MIPs對HJMS形成高親和性結合位點和低親合性結合位點[23]，其原因是在聚合過程中，替代模板分子與功能單體形成比例不同的復合物，使非共價結合作用力的大小不均勻[24]。以這兩段線性關系為依據，分別進行線性擬合，得到MIPs的Scatchard擬合方程Q/C=267.206 6-15.280 5Q(R2=0.999 7)和Q/C=145.829 9-3.239 3Q(R2=0.969 5)，其中Q為MIPs對花椒麻味物質的吸附容量、C為吸附平衡時花椒麻味物質的質量濃度。由Scatchard曲線(圖6)的斜率和截距計算可得：高親和力結合位點的離解常數為Kd1=6.544×10-2mg/mL，結合位點最大結合量為Qmax1=17.487mg/g；低親和力結合位點的離解常數為Kd2=3.087×10-1mg/mL；結合位點最大結合量為Qmax2=45.019 mg/g。NIPs的Scathcdard模型可擬合成一條直線，這是因為NIPs只存在一種非特異性的吸附位點[25]。

圖7 分子印跡聚合物對HJMS的Scatchard分析圖Fig.7 Scatchard Plots Analysis of MIPs and NIPs for HJMS and LM2

3 結論

本實驗采用成功合成的LM2為替代模板分子，本體聚合的方法制備了MIPs，MIPs與HJMS接觸時間約10 h可達到吸附平衡，對花椒麻味物質特異因子α可達到2.53；在吸附過程中HJMS與MIPs形成兩種結合位點，高親和力結合位點的離解常數為Kd1=6.544×10-2mg/mL，結合位點最大結合量為Qmax1=17.487 mg/g；低親和力結合位點的離解常數為Kd2=3.087×10-1mg/mL，結合位點最大結合量為Qmax2=45.019 mg/g；結果表明，MIPs對花椒麻味物質表現出優異的特異性吸附能力。