諾麗果控溫發酵過程中理化性質和活性物質的變化規律

郝玉潔，毛丙永，崔樹茂，易美華，洪啟恩，陳衛，趙建新*

1(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122)2(海南諾尼生物工程開發有限公司，海南 ?？?，570100)

諾麗發酵汁是在波利尼西亞流傳了2 000多年的傳統食物和藥物。諾麗果因為成熟后質地軟爛，容易破損[1]，不易運輸和保存，因此就地發酵是較好的處理方法。諾麗果具有很高的營養價值，許多熱帶地區開始了具有規模性的諾麗發酵汁的生產與銷售。諾麗果發酵大多采用長時間密封靜置發酵的方式，但不同地區、不同廠家采用的發酵條件并不統一，缺乏明確的指標，產品標準不統一、品質不穩定，缺乏對諾麗發酵過程的研究。因此，研究諾麗發酵過程中理化和成分變化規律是十分必要的，根據變化規律來指導生產，保證產品品質穩定[1-6]。

諾麗果中含有大量活性物質，如多酚[3-4]、黃酮、多糖和環烯醚萜類物質，有機酸、揮發性風味物質等[7]，對產品質量具有重要影響。本文以西沙諾麗果為研究對象，通過研究諾麗果汁發酵過程中關鍵理化指標(pH值、總滴定酸度、可溶性固形物)、活性成分(總糖、總酚、環烯醚萜等)以及有機酸、揮發性風味物質等的變化規律，為諾麗果汁發酵提供研究基礎，具有重要的指導意義和參考價值。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

諾麗果由海南諾尼生物工程開發有限公司提供。車葉草苷酸和去乙酰車葉草苷酸來自于南京森貝伽生物科技有限公司；氫氧化鈉、蒽酮、濃硫酸、福林酚試劑和碳酸鈉等試劑均來自于國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 主要儀器設備

WAY-2W阿貝折光儀，上海儀電物理光學儀器有限公司；UV1800紫外可見光分光光度計，日本島津公司；氣相色譜-質譜聯用儀1300-ISQ Thermo/Trace GC-MS，賽默飛世爾科技公司；超高效液相色譜-質譜聯用儀UPLC-TQD ，美國沃特世公司；高效液相色譜儀Waters 1525EF ，美國沃特世公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 諾麗果汁的制備方法

取新鮮的諾麗果洗凈表面，瀝干后置于密封發酵罐中，于37 ℃恒溫培養箱中發酵，定期從發酵罐中取出諾麗果浸出汁并保存在-80 ℃冰箱，以備檢測使用。

1.3.2 pH、總滴定酸度(total titratable acid，TTA)和可溶性固形物(total soluble solids, TSS)的測定

pH和TTA的檢測方法參考國標《GBT 15038—2006 葡萄酒、果酒通用分析方法》。TSS的測定方法按照國標《GBT 12143—2008 飲料通用分析方法》。

1.3.3 有機酸的測定

諾麗果汁中有機酸參考丁仁君[8]的方法。將諾麗果汁離心后微濾(0.45 μm)過膜，HPLC分析。采用Ecosil C18色譜柱，流動相為甲醇-水-H3PO4溶液(體積比95∶5∶0.05)，柱溫30 ℃，流速0.8 mL/min，進樣量為5 μL，UV檢測(210 nm)。

1.3.4 總糖和總酚的測定

總糖采用蒽酮比色法進行檢測。取10 mL待測樣品于3 000 r/min離心10 min，取上清液適當稀釋。取1 mL樣品稀釋液于具塞試管中，后加入4 mL蒽酮試劑，沸水浴10 min，冰水迅速冷卻，于620 nm波長下測定吸光值。以葡萄糖標準溶液作標準曲線，計算總糖含量。

總酚采用福林酚法檢測[9]。

1.3.5 環烯醚萜含量的檢測

環烯醚萜采用UPLC-MS方法進行檢測。取10 mL待測樣品于3 000 r/min離心10 min。取1mL上清液加適量的甲醇水溶液稀釋。稀釋后的溶液過0.22 μm微孔濾膜待測。色譜條件如下：Waters XBridge C18柱，流動相(A)乙腈，(B)1%甲酸水溶液(v/v)，流動速率為0.3 mL/min。流動相按以下程序變化：0～0.5 min，3% A；0.5～6 min，3%～30% A；6～8 min，30%～50% A；8～9 min，50%A；9～10 min，50%～100% A；10～11 min，100% A；11～11.5 min，3% A。進樣溫度：130℃。進樣量：1 μL。電離方式：ES-。電離能量：70 eV。監測離子：定量離子為m/z 389、431。以車葉草苷酸和去乙酰車葉草苷酸標準溶液繪制標準曲線，外標法定量。

1.3.6 揮發性成分的測定

揮發性成分測定采用GC-MS法。樣品采用固相萃取法提取，萃取頭型號為50/30 μm DVB/CAR/PDMS，樣品在40℃下加熱，插入萃取頭萃取5 min，后插入進樣口釋放5 min。升溫程序為初始溫度40 ℃；30 ℃/min升溫至60 ℃；10℃ /min升溫至180 ℃；20 ℃/min升溫至220 ℃，保溫2 min。Rtx-WAX毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 mm)，進口溫度為230 ℃，分流比15∶1，柱流速1 mL/min，載氣為氦氣。質譜條件：離子化方式EI，發射能量為70 eV。采用面積歸一化法表示各個揮發性成分的含量。

1.3.7 數據處理及分析

采用Origin 8.5對實驗數據進行繪圖，SPSS 19.0軟件對所得數據進行統計分析，選擇Duncan進行顯著性檢驗。

2 結果與討論

2.1 諾麗果發酵過程中pH、TTA和TSS的變化規律

如圖1所示，諾麗果汁在發酵過程中pH在60 d以前由3.9緩慢下降，在60 d以后穩定在3.6左右。WALL[2]等研究諾麗果在22 ℃下自然發酵時pH的變化范圍為3.5～3.9，與本研究結果相符。總滴定酸度在20 d以前迅速上升，由7 mg/mL升至9 mg/mL，之后緩慢上升，在第100天TTA約為10.3 mg/mL。梁寒峭等人提到TTA的含量在滅菌前為8 g/L，pH為3.7，與本文結果相近[10-11]。由此可見，諾麗果汁在發酵60 d后pH和TTA已基本保持穩定。TSS在發酵前16 d變化不明顯，這可能與前期諾麗果仍較硬、結構緊實有關。第16天到第30天，TSS迅速升高。30 d后可溶性固形物含量基本穩定，在7.5%～8%。

圖1 諾麗果汁發酵過程中pH和TTA的變化情況Fig.1 Changes in pH and TTA during noni fermentation

圖2 諾麗果汁發酵過程中可溶性固形物的變化情況Fig.2 Changes in the total soluble solids (TSS) during noni fermentation

2.2 諾麗果發酵過程中有機酸的變化規律

諾麗果發酵過程中TTA逐漸增加，為了探究具體有機酸的變化情況，針對甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、蘋果酸和富馬酸這8種有機酸進行檢測。其中乙酸和富馬酸的含量低于0.01 mg/mL，并未在圖3中展示。由圖3可以看出，發酵過程中含量變化最大的是丁酸，丁酸在發酵前6天含量上升，后迅速下降，這可能與諾麗果的成熟有關，經發酵可以有效減少丁酸這種不良氣味的存在[7]。蘋果酸、丙酸緩慢增加，戊酸和己酸緩慢降低，甲酸基本不變。蘋果酸含量較高，是諾麗果中主要的非揮發性有機酸[12-13]。

圖3 諾麗果汁發酵過程中有機酸的變化情況Fig.3 Changes in the organic acids during noni fermentation

2.3 諾麗果發酵過程中總糖和總酚的變化規律

由圖4可知，在諾麗果發酵過程中總糖的含量呈波動性變化，基本維持在45～50 mg/mL的范圍內?？偡雍康淖兓鐖D5所示。

圖4 諾麗果汁發酵過程中總糖含量的變化情況Fig.4 Changes in the total carbohydrate content during noni fermentation

圖5 諾麗果汁發酵過程中總酚含量的變化情況Fig.5 changes in total polyphenol contents during noni fermentation

總酚含量在前40天不斷降低，尤其是在前20天從1.20 mg/mL迅速下降到1.05 mg/mL，到第40天緩慢下降到1.00 mg/mL，之后基本穩定。李雪等人比較西沙諾麗果汁和大溪地諾麗果汁時發現粗多糖含量為50～70 mg/mL，多酚的含量為1.1 mg/mL左右，與本文研究結果基本符合[9, 14]。長時間發酵會降低諾麗果汁的抗氧化能力[15]，多酚含量也會降低，因此諾麗果汁的發酵時間不宜過長。

2.4 諾麗果發酵過程中環烯醚萜的變化規律

諾麗果中的環烯醚萜類物質主要是車葉草苷酸和去乙酰車葉草苷酸兩種，車葉草苷酸的含量在發酵過程中逐漸減少，而去乙酰車葉草苷酸的含量呈波動變化，一直維持在2 mg/mL的水平，結果表明隨著發酵過程的進行，環烯醚萜類物質的含量變化不大。李雪等人采用HPLC對諾麗果汁中車葉草苷酸含量進行了測定，其檢測結果為0.179 mg/mL，與本文研究結果相近[16]。

圖6 諾麗果汁發酵過程中環烯醚萜類物質含量的變化情況Fig.6 Changes in the iridoids content during noni fermentation

2.5 諾麗果發酵過程中揮發性物質的變化規律

諾麗發酵果汁最顯著的特點就是它奇特的味道，也正是這獨特的味道讓諾麗發酵果汁具有很高的辨識度。為了進一步探究諾麗果汁在發酵過程中的物質變化規律，先從較為明顯的揮發性成分著手。采用SPME-GC-MS法分析了諾麗發酵果汁的揮發性物質，結果如圖7所示。

圖7 PCA法分析諾麗果汁發酵過程中揮發性物質的變化情況Fig.7 PCA analysis of changes in the volatile flavor compounds during noni fermentation

可以明顯看出，第2、20、40天及第60～100天分別居于不同的4個象限，說明諾麗果汁的發酵過程是具有階段性的，在發酵后期趨于穩定，處在一個階段里。PINO等通過研究也指出諾麗果在自然發酵60 d后風味物質會達到穩定狀態[17]，與本文的研究結果相吻合。

諾麗果汁揮發性成分共檢測出46種，其中含量占比在1%以上的物質有7種(見表1)，代表了約80%的物質。其中己酸和辛酸是諾麗果汁中主要的揮發性有機酸，也是諾麗果汁腐臭味的主要來源。這與JORGE等人的研究結果相同[12]。此外，2-庚酮的顯著性變化與諾麗果發酵的階段特性相吻合，其他6種物質在發酵過程中變化不明顯。己酸和辛酸的酯類化合物是諾麗果和諾麗果汁中較為典型的酯類化合物，大多數呈強烈的果味[18]。

表1 諾麗果汁揮發性成分中含量占比超過1%的物質的變化情況Table 1 Changes in volatile components of more than 1% during noni fermentation

注：表格中數值為含量占比的百分數，右上角的不同小寫字母代表組別間差異顯著(p<0.05)。

諾麗果汁揮發性成分中選取含量占比在0.1%以上的物質，共17種，代表了98%以上的揮發性物質。其中有顯著性差異的有7種(見表2)。其中，2-甲基有丁酸的含量逐漸增加，在80 d后趨于平穩；1-吡咯烷甲腈和癸酸甲酯一直增加；2-庚酮、4-丁酸戊烯基酯、丁酸甲酯的含量階段性減少；異丁烯酸甲酯一直減少。

2-甲基丁酸有辛辣味[19]，不容易被消費者接受，隨著發酵時間延長并不有利于產品被新的消費者接受。2-庚酮[20]、丁酸甲酯和異丁烯酸甲酯都具有令人愉悅的果香，但在發酵過程中會逐漸減少，也不利于產品保留較好的風味。因此，較短的發酵時間可以盡可能地保留諾麗果汁的良好氣味，更有利于被接受。

表2 諾麗果汁揮發性成分在發酵過程中顯著變化物質的變化情況Table 2 Changes in volatile components with significant changes during noni fermentation

注：表格中數值為含量占比的百分數，右上角的不同小寫字母代表組別間差異顯著(p<0.05)。

3 結論

諾麗果汁的pH隨發酵時間逐漸降低，在60 d后趨于平緩；TTA和TSS隨發酵時間逐漸升高，在40 d后趨于穩定。多酚化合物的含量隨發酵時間逐漸降低，在40 d后基本保持不變。多酚化合物的抗氧化能力與其含量成正比，因此縮短發酵時間，對提高諾麗產品的功效有重要的意義。

8種有機酸中，丁酸的含量在發酵10 d后迅速下降，其余有機酸的含量在發酵過程中變化均不明顯。從揮發性物質的主成分分析結果看諾麗果的發酵具有明顯階段性，在60 d后基本穩定。根據2-甲基丁酸、2-庚酮、丁酸甲酯和異丁烯酸甲酯的含量變化結果，縮短發酵時間有利于保留諾麗果汁的良好風味，更容易被消費者接受。

綜上，諾麗果汁的發酵過程是有階段性的，在工藝允許的情況下縮短發酵時間有助于改善諾麗果汁的品質。