乳酸菌發(fā)酵對桑葚漿品質(zhì)及抑菌性能的影響

蘇能能，關(guān)倩倩，彭珍，肖陽生，于紅，程浩，熊濤

(南昌大學 食品學院，食品科學與技術(shù)國家重點實驗，江西 南昌，330031)

桑葚，又名桑椹子、桑棗、桑果，具有美容養(yǎng)顏[1]、生津潤燥、烏發(fā)明目[2-3]、補肝益腎[4]等功效。目前的研究多側(cè)重其保健成分花青素、多糖等[5-7]，而益生菌發(fā)酵桑葚加工方面的研究隨著益生菌發(fā)酵產(chǎn)品的火熱也越來越多。近年來，徐輝艷等人[8]用葡萄酒酵母BM45和ASL41醋酸菌發(fā)酵桑葚，優(yōu)化發(fā)酵工藝得到保健型果醋；黃星源等人[9]利用酵母菌對桑葚進行發(fā)酵，得到品質(zhì)優(yōu)良的桑葚果酒；邱怡筠等人[10]利用酵母菌對桑葚、草莓復(fù)配物發(fā)酵，得到桑葚草莓復(fù)合果酒等。然而，以桑葚為原料，利用乳酸菌發(fā)酵桑葚的研究還較少，軟飲料行業(yè)有必要增大對桑葚的開發(fā)。

本實驗以乳酸菌發(fā)酵桑葚漿為對象，分析發(fā)酵前后桑葚漿品質(zhì)及抑菌性能的變化，為桑葚發(fā)酵制品及相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

桑葚，品種黑珍珠，采購于上海浦東區(qū)白鶴鎮(zhèn)白石公路興利路采摘園，位于東經(jīng)121°08′、北緯31°15′；植物乳桿菌(NCU137)、金黃色葡萄球菌(CMCC 26003)、大腸桿菌(CMCC 44350)、銅綠假單胞菌(CMCC 10104)、鼠傷寒沙門氏菌(ATCC 13311)，由食品科學與技術(shù)國家重點實驗室提供。

1.2 儀器與設(shè)備

ZSD-A1160A全自動新型生化培養(yǎng)箱，上海精宏試驗設(shè)備有限公司；YXQ-LS50SⅡA/B3生物安全柜，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；YXQ-LS-50SⅡ立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；實驗室pH計FE30，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；Aglient1260液相色譜，美國Agilent公司；精密電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；S-443D型氨基酸分析儀，德國塞卡姆公司；蘇泊爾SJ201A-250型榨汁機，浙江蘇泊爾股份有限公司；Agilent 7890/7000A三重串聯(lián)四級桿氣質(zhì)聯(lián)用儀，美國Agilent公司；手動固相微萃取進樣器、50/30 μm DVB /CAR/PDMS57328-U萃取頭，美國Supelco公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵桑葚漿樣品的制備

解凍已清洗、去雜的桑葚鮮果，去梗后置于打漿機中打漿。將果漿裝瓶后102 ℃滅菌20 min[11]，冷卻至室溫，接種活化后的植物乳桿菌(NCU137)，接種量為0.03‰(m/m)，37 ℃恒溫發(fā)酵60 h，定期取樣。以打漿后的新鮮桑葚漿作為對照組，于-18 ℃冰箱中凍存。

1.3.2 理化指標的測定

1.3.2.1 活菌數(shù)與pH值的測定

采用梯度稀釋平板涂布法測定植物乳桿菌(NCU137)活菌數(shù)，果漿pH值由pH計直接測得。

1.3.2.2 糖類及乳酸的測定

糖類及乳酸的測定參照XIONG[12]等的方法并略作改進。樣品經(jīng)12 000 r/min低溫離心10 min后，將上清液過0.45 μm水系濾膜，取濾液上液相測定。色譜條件：Aminex HPX-87H色譜柱；流動相為5 mmol/L的硫酸水溶液；流速0.5 mL/min；柱溫35 ℃；紫外檢測器波長210 nm；手動進樣，進樣量20 μL。示差檢測器測定蔗糖、葡萄糖、果糖，紫外檢測器測定乳酸、檸檬酸。

1.3.3 游離氨基酸的測定

果漿經(jīng)3 000 r/min低溫離心5 min，準確取上清液1 mL加20 g/L的磺基水楊酸9 mL混勻、靜止15 min后離心留上清過膜(0.45 μm)得待檢液。待檢液上氨基酸分析儀，檢測參數(shù)：流動相檸檬酸鈉溶液(A0.12 mol/L pH 3.45；B0.2 mol/L pH 10.85)；檢測波長510 nm、440 nm；茚三酮反應(yīng)顯色；58～74 ℃梯度控溫，45 min標準解析。

1.3.4 香氣成分測定

利用固相微萃取結(jié)合氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(SPME-GC-MS)測定桑葚漿發(fā)酵前后的香氣成分。

1.3.4.1 香氣的萃取

參照陳娟[13]、吳瓊[14]、劉瑋[15]等的方法略作改進，精確稱取6 g果漿樣品于頂空瓶中，瓶身置于45 ℃恒溫水浴鍋中水浴30 min，將預(yù)先老化的萃取針(50/30 μm DVB/CAR)插入頂空瓶，持續(xù)恒溫萃取30 min，取出萃取頭并手動進樣送至GC-MS中，250 ℃解析5 min。

1.3.4.2 GC-MS檢測條件

根據(jù)劉瑋[15]等的方法，色譜柱：HP-5MS毛細管柱；升溫程序：起始溫度40 ℃，保持5 min，以10 ℃/min升至240 ℃，保持2 min；載氣為高純氦氣，流速1.0 mL/min；不分流進樣。質(zhì)譜接口溫度為280 ℃，離子源溫度為230 ℃，電離方式EI，離子能量70 eV，質(zhì)量掃描范圍為20～350 U。

1.3.4.3 氣成分的定性定量

香氣成分采用Wiley7n.1質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索并結(jié)合參考文獻[13-15]進行定性分析。用峰面積歸一化法進行各種香氣成分相對含量的計算，即各種香氣物質(zhì)的峰面積占總揮發(fā)性成分總出峰面積的百分數(shù)。每個樣品重復(fù)3次，各種香氣成分相對含量取平均值。

1.3.5 桑葚漿發(fā)酵前后抑菌性能的變化

1.3.5.1 指示菌與樣液的制備。

(1)指示菌制備：LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)指示菌，37 ℃恒溫培養(yǎng)20 h，指示菌稀釋合適梯度，平板涂布使指示菌濃度107CFU/mL以上。

(2)樣液制備：稱取果漿20 g，4 500 r/min離心10 min留上清，過0.45 μm膜備用。

(3)陽性組：精確稱取0.1 g青霉素鈉(80萬單位，簡寫Amp)，蒸餾水稀釋配成50、100 μg/mL兩種溶液，分別標記為Amp50、Amp100。

1.3.5.2 抑菌性能的測定[16]

將4種指示菌均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基上，輕放牛津杯。取200 μL樣液分別加入牛津杯中(n=3)，平穩(wěn)輕移至培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)12 h。游標卡尺測其抑菌圈直徑作為指標，探究產(chǎn)品抑菌性能，Amp50、Amp100為陽性對照。抑菌直徑均以3次實驗的平均值表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑葚漿發(fā)酵前后理化指標的分析

2.1.1 桑葚漿發(fā)酵過程中pH值與活菌數(shù)的動態(tài)變化

活菌數(shù)與pH值的動態(tài)變化是衡量桑葚發(fā)酵的基礎(chǔ)參數(shù)，其動態(tài)變化見圖1。

圖1 發(fā)酵桑葚過程中pH值與活菌數(shù)的動態(tài)變化Fig.1 Dynamic change in pH value and viable cell counts during mulberry fermentation

由圖1可知桑葚接種NCU137初始濃度為1.85 ×107CFU/mL；經(jīng)短暫的調(diào)整后進入對數(shù)期，在24 h進入穩(wěn)定期約為1.08 ×1010CFU/mL；發(fā)酵結(jié)束時植物乳桿菌NCU137(簡稱NCU137)的活菌數(shù)仍保持1010CFU/mL。在發(fā)酵體系中隨著NCU137大量增殖，果漿的pH迅速降低：當NCU137處于延滯期時pH值降低微弱，由4.17降低到4.15；進入對數(shù)期后，pH值由4.15迅速降低至3.65；達到穩(wěn)定期時，pH值趨于平穩(wěn)為3.51。這種變化趨勢表明NCU137能夠在桑葚漿中大量增殖，且在較低的pH環(huán)境下仍具有很強的耐受性及存活力。此外，高濃度的活菌數(shù)表明乳酸菌發(fā)酵桑葚具有開發(fā)活菌產(chǎn)品的潛力。

2.1.2 桑葚漿發(fā)酵前后糖類與有機酸的變化

以桑葚漿為基底，通過乳酸菌的代謝，糖類被不同程度的消耗，乳酸逐漸積累(表1)，色譜圖見圖2(A、C鮮果漿，B、D發(fā)酵漿)。圖2顯示，桑葚漿中3種糖類均出現(xiàn)不同程度的降低，檸檬酸略有降低，乳酸增加顯著。鮮果漿中葡萄糖含量最高，為17.4 g/L，其次是果糖15.57 g/L，蔗糖含量較少0.31 g/L；在發(fā)酵漿中通過NCU137的消耗，發(fā)酵結(jié)束時葡萄糖濃度降低至10.69 g/L，降低了6.71 g/L；果糖的消耗量為5.82 g/L，略低于葡糖；在發(fā)酵體系中蔗糖變化不顯著，可能因為有單糖的存在且含量是蔗糖的30多倍，所以在整個體系中乳酸菌對蔗糖利用很少。檸檬酸是桑葚的主要有機酸之一[17]，在鮮果中含有5.25 g/L，發(fā)酵后降低到3.69 g/L，可能是參與了風味物質(zhì)的形成或轉(zhuǎn)化為乳酸[18]。乳酸是乳酸菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，由發(fā)酵前的3.13 g/L，增加至19.86 g/L。僅從糖酸轉(zhuǎn)化的角度考慮，理論上消耗的糖類轉(zhuǎn)化為乳酸的量約為12.60 g/L。即使包括檸檬酸的轉(zhuǎn)化，理論上乳酸的產(chǎn)量僅為14.16 g/L，這種現(xiàn)象說明桑葚中產(chǎn)生的乳酸并不完全來自葡萄糖、果糖、蔗糖、檸檬酸，可能來自氨基酸的轉(zhuǎn)化，其他糖類的降解。這種轉(zhuǎn)化可能是乳酸積累到一定程度導(dǎo)致pH值降低抑制了葡萄糖相關(guān)的酶系同時激發(fā)了氨基酸、脂類、其他多糖類等相關(guān)的酶系參與能量的供應(yīng)[19-21]。

表1 桑葚發(fā)酵前后主要有機酸與糖的變化Table 1 Change of major organics and glucide after fermentation of mulberry

注：表中不同字母標注代表存在顯著性差異，相同字母代表無顯著性差異，下同。

1-蔗糖；2-葡萄糖；3-果糖；4-檸檬酸；5-乳酸圖2 桑葚漿發(fā)酵前后主要糖類、有機酸液相色譜圖Fig.2 Liquid chromatogram of major saccharides, organic acids before and after mulberry fermentation

2.2 桑葚漿發(fā)酵前后游離氨基酸的變化

對微生物而言，游離氨基酸不僅為機體提供能量，而且是生化反應(yīng)中香氣成分形成的一個重要來源[22]。桑葚漿發(fā)酵前后游離氨基酸的變化見表2，結(jié)果顯示了鮮果漿、發(fā)酵中期(發(fā)酵漿30 h)、發(fā)酵結(jié)束(發(fā)酵漿60 h)3個階段游離氨基酸的變化。由表2可知新鮮漿果中游離氨基酸總量約為88.10 mg/100 g，發(fā)酵30 h后降低至69.72 mg/100 g、結(jié)束時為68.98 mg/100 g，整體下降19.12 mg/100 g。在檢測的14種氨基酸中，半胱氨酸在鮮果中未檢測到(圖3-A)而在發(fā)酵漿中出現(xiàn)(圖3-B)，最終含量為0.80 mg/100 g((圖3-C)。整個發(fā)酵體系中，除蛋氨酸、谷氨酸外其他12種氨基酸均有顯著變化。其中絲氨酸含量最高，在原料中占總量的39.25%為34.58 mg/100 g，發(fā)酵后降低至29.38 mg/100 g，占總量的42.59%。絲氨酸可能通過去氨基作用生成α-酮酸，隨后參與一系列的反應(yīng)轉(zhuǎn)化為有機酸、醇、酯類等成分[19]。丙氨酸雖然在含量上不高，但整個發(fā)酵過程中降低了5.80 mg/100 g,變化量最大，可能通過脫氨基作用轉(zhuǎn)化為丙酮酸隨后參與乳酸的生成[19,21]。總之，桑葚發(fā)酵前后游離氨基酸的變化體現(xiàn)了它們參與三羧酸循環(huán)(TCA循環(huán))、乳酸生成及揮發(fā)性成分代謝的一種可能與潛力。

表2 桑葚發(fā)酵前后游離氨基酸的變化Table 2 Change of free ammo acids after fermentation of mulberry

A-鮮果漿；B-發(fā)酵漿(30 h)；C-發(fā)酵漿(60 h)圖3 桑葚漿發(fā)酵前后氨基酸色譜圖Fig.3 Amino acid chromatogram of different stage in mulberry fermentation

2.3 桑葚漿發(fā)酵前后揮發(fā)性成分的變化

揮發(fā)性成分是產(chǎn)品感官質(zhì)量的重要指標，也是產(chǎn)品被消費者認可的重要因素之一，備受研究者關(guān)注。桑葚的品種有很多，本研究中所用的品種黑珍珠的揮發(fā)性成分主要包括酯類、醇類、烯酸類和其他，如表3所示。其中1-己醇-4-甲基乙酸酯、丁酸乙酯、2-甲基戊酸甲酯、3-甲基-1-戊醇、(Z)-8-甲基-4-十一碳烯等是鮮果的主要特征香氣成分，相對含量分別是11.859%、11.923%、9.827%、40.263%、5.911%占揮發(fā)性成分的79.783%，它們構(gòu)成黑珍珠的骨架香氣體系。鮮果中檢測到26種揮發(fā)性成分，經(jīng)乳酸菌作用后16種揮發(fā)性成分消失，與此同時20種鮮果中未有的揮發(fā)性成分通過代謝產(chǎn)生。在發(fā)酵漿中棕櫚酸乙酯、甲基十四烷基碳酸酯、2-甲基戊酸甲酯、丁酸乙酯、3-甲基-1-戊醇、沉香醇、5-甲基-1-己醇、2-異丙基-5-甲基己酯乙酸等8種化合物構(gòu)成其關(guān)鍵致香成分，相對含量為7.382%、3.120%、9.730%、3.219%、48.838%、1.196%、4.316%、3.114%占總含量的80.915%。果漿經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后酯類由45.311%降至34.553%，醇類42.090%升至56.996%，這兩類物質(zhì)是構(gòu)成香氣變化的主要成份，對該品種桑葚特征香氣具有顯著貢獻。

注：ND表示未檢測出

酯類是果香中常見的一類揮發(fā)性成分，給人愉悅誘人的氣味體驗。在桑葚發(fā)酵前后酯類種類最多且變化顯著：種類雖然前后均為14種，但僅有5種相同，在整體上由45.311%降低到34.553%。桑葚中的丁酸乙酯具有香蕉、蘋果、鳳梨香[24]，經(jīng)發(fā)酵作用降低了8.704%，可能是原料在加工過程中受熱擴散所致；棕櫚酸乙酯呈微弱蠟香和奶油香，發(fā)酵后由1.535%上升至7.382%，可通過醇類與有機酸酯化作用生成[25]。2-甲基戊酸甲酯具有漿果、菠蘿蜜、甜瓜等果香[26]，是桑葚的主體香。雖相對含量發(fā)酵前后變化不明顯，但在發(fā)酵漿中是含量最高的酯類物質(zhì)，表明加工后保留了桑葚固有的香型。醇類是該品種桑葚相對含量較高的一類，鮮果40.263%、發(fā)酵漿48.838%。與酯類不同，醇類種類相對較少，鮮果中僅有5種醇類。鮮果中的沉香醇、4-萜品醇、3-甲基-1-戊醇，在發(fā)酵后均有所增加，其他2種醇類消失，新產(chǎn)生了5種醇類。3-甲基-1-戊醇是桑葚相對含量最高的一種揮發(fā)性成分，發(fā)酵前40.263%上升到48.838%。醇類化合物的增加由乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生，可能來源于果漿或菌體的蛋白質(zhì)及氨基酸受酶系作用發(fā)生脫氨、脫羧從而降解生成醇類，也有可能來源于糖類，其通過糖酵解產(chǎn)生的丙酮酸進入TCA循環(huán)進而參與氨基酸轉(zhuǎn)化、有機酸傳遞、醇類、酯類等成分形成與演變[20,27-28]。醇類是酯類化合物的前驅(qū)物質(zhì)，其香氣特征主要是水果香和花香[29]，如桑葚發(fā)酵后產(chǎn)生的沉香醇屬于鏈狀萜烯醇類，是在香料使用普遍的一種物質(zhì)，具有鈴蘭香氣[30]。

2.4 桑葚漿發(fā)酵前后抑菌性能變化

抑菌性能有助于產(chǎn)品的保存。桑葚發(fā)酵漿前后的抑菌性變化見圖4。桑葚鮮果本身因含有機酸和花青素而具有抑菌效果[31]，但因其糖含量高、pH值偏高故抑菌效果不佳。圖4可知，鮮果漿對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、鼠傷寒沙門氏菌4種致病菌均有抑制作用，抑菌圈分別為14.74±0.39、13.78±0.37、12.57±0.38、13.36±0.07 mm。桑葚漿發(fā)酵后抑菌性能顯著增強，抑菌圈分別為22.82±0.49、24.34±0.38、24.18±0.18、17.71±0.45 mm，變化極顯著。桑葚漿通過乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生了大量的抑菌物質(zhì)如：乳酸、細菌素、胞外多糖、小肽等增強了果漿的抑菌性能[32-33]。把發(fā)酵桑葚漿的抑菌性能換算成青霉素鈉當量：在抑制鼠傷寒沙門氏菌(沙門)方面，發(fā)酵桑葚漿抑菌性能與Amp50效果相當；在銅綠假單胞菌(銅綠)和金黃色葡萄球菌(金葡)的抑制方面，發(fā)酵漿抑菌性能略低于Amp50；但在大腸桿菌(大腸)的抑制方面，發(fā)酵漿的抑菌性能介于Amp50與Amp100之間。這種顯著提高的抑菌效果有助于綠色健康產(chǎn)品的開發(fā)與應(yīng)用。

圖4 發(fā)酵桑葚前后抑菌性能的變化Fig.4 Change of antibacterial properties in fermentationof mulberry(注：圖中不同字母標注代表存在顯著性差異，相同字母代表無顯著性差異)

3 結(jié)論

本文以桑葚漿為原料通過乳酸菌發(fā)酵，測定了桑葚漿發(fā)酵過程中的理化指標，分析了發(fā)酵前后桑葚漿的品質(zhì)變化。結(jié)果顯示，桑葚經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后，保健功效得以顯著提高：經(jīng)NCU137發(fā)酵后，活菌數(shù)增至1.08×1010CFU/mL，有助于桑葚活菌飲料的開發(fā)；發(fā)酵后桑葚中主要有機酸由8.38 g/L增至23.55 g/L，賦予了開發(fā)綠色健康飲料方面對酸的需求，有助于拓寬桑葚產(chǎn)品種類；乳酸菌發(fā)酵改變了桑葚香氣的種類，保持了它的主體香且增加了香氣種類，使果漿更醇香；與鮮果對比，發(fā)酵漿抑菌性能顯著增強，大大提高了產(chǎn)品的貯藏穩(wěn)定性，符合大眾對健康綠色食品的追求。總之，桑葚經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后，在品質(zhì)與抑菌性方面均有顯著性的改善，本研究為乳酸菌發(fā)酵桑葚制品及相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)提供一些參考與理論支持。但是本研究也有局限性，僅對部分指標分析討論，后續(xù)可增加活性成分花青素、白藜蘆醇、黃酮等方面的測定，以期更全面分析乳酸菌發(fā)酵對桑葚漿品質(zhì)及抑菌性能的影響。