生物玻璃復合P-15多肽修復兔顱骨缺損的實驗研究

王帥，李成庫，周延民（.遵義醫學院附屬口腔醫院科研科，貴州遵義563000；.吉林大學口腔醫學院，吉林長春300）

大體積骨缺損仍是醫學尚未解決的重大難題之一。自體骨移植仍被認為是修復骨缺損的“金標準”，然而其應用受到許多限制，如需開辟第二術區、手術時間長、引起供區損傷、可取骨量有限、植入后骨吸收等。近年來，異質移植材料及人工合成材料的研究應用取得了很大進展。已有許多生物活性蛋白與各類支架材料復合以提高人工骨替代材料成骨能力的文獻報道[1-2]；但蛋白與支架材料的吸附與緩釋，以及重組蛋白的成本及活性問題等限制了其臨床應用。而黏附肽類保留了相關蛋白中發揮生理作用的主要成分，參與了細胞生物力信號的傳導，可促進細胞黏附、增殖、分化等，且空間構象相對固定，合成簡單，P-15多肽就是其中的代表。

骨的有機成分中90%以上是由Ⅰ型膠原構成的，在其α1鏈上一段與間充質細胞結合且高度保守的15個氨基酸序列被稱為P-15[3]。其能與各種前體細胞上的整合素受體結合，促進細胞黏附，釋放生成因子，協同促進成骨細胞前體細胞的分化。攜帶P-15多肽的無機牛骨（PepGen P-15TM）在口腔上頜竇提升術[4]、牙周組織再生[5]，以及同富血小板纖維蛋白合用于骨再生[6]多有文獻報道，顯示了這種骨替代材料一定的優越性。

生物玻璃是通過美國食品藥品監督管理局認證的人工骨材料，其與體液接觸后經一系列化學反應，在材料表面形成富含硅的凝膠層，在此表面磷酸鈣聚集晶化形成碳酸羥基磷灰石，膠原和一些黏多糖也被吸附，新生的骨質層可與生物玻璃緊密結合在一起[7]。因此，本研究聯合生物玻璃與P-15多肽各自的優點用于骨缺損動物模型的修復，為以仿生多肽為基礎的生物材料的研究提供理論和實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 P-15序列為GTPGPQGIAGQRGVV，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；高效液相色譜法分析其純度為96.28%，質譜圖報告結果相對分子質量為1 393.58 D。生物玻璃購自北京國藥前景公司，速眠新麻醉劑Ⅱ、陸醒寧通用名等由解放軍軍需大學提供，杜氏改良Eagle培養基購自美國Gibco公司，胎牛血清購自奧地利PAA公司，堿性磷酸酶（ALP）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.1.2 儀器 二氧化碳恒溫細胞培養箱（日本三洋公司）、超凈工作臺（上海博訊醫療生物儀器股份有限公司）、倒置顯微鏡（OLYMPUS CKX41型）、GIOTTO鉬靶軟X線機（意大利IMS公司）、石蠟切片機（德國Letiz公司）、紫外分光光度儀U-2910（日本日立公司）等。

1.1.3 實驗材料 選取Wistar大鼠10只（體重90.0～110.0 g）、5月齡雄性日本大耳白兔18只（體重2.1～2.8 kg），由吉林大學動物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 細胞獲取與培養 將Wistar大鼠采用速眠新麻醉劑Ⅱ進行局部麻醉，固定于木板上，放血處死。完整取下股骨至足部，去皮，于75%乙醇內浸泡5 min，全程保證大鼠骨骺段組織完整。在超凈工作臺上小心擰下股骨遠心端，暴露干骺端，用20 mL注射器吸取約10 mL培養基，插入骨骺內抽取骨髓，邊吸取邊注入離心管內。脛骨給予相同處理。雙下肢吸取完畢后用吹管吹打離心管內組織塊，1 000 r/min離心5 min，輕輕吹打離心管底部沉淀制成細胞懸液，移至100 mm培養皿中，輕輕搖晃培養皿，使細胞及組織均勻分布，在倒置顯微鏡下觀察細胞多層懸浮，置于37℃、含5%二氧化碳及飽和濕度細胞培養箱內。48 h后首次換液，去除血細胞及其他懸浮細胞。視野內可見圓形細胞、梭形多角細胞集簇分布。以后3 d更換1次培養液。每天用倒置顯微鏡觀察細胞生長狀況和形態變化。待細胞生長匯合達80%以上時消化傳代。用第3代細胞接種材料。

1.2.2 材料與骨髓基質細胞共培養及ALP活性檢測 用電子分析天平稱取2 mg P-15多肽，溶于2 mL磷酸鹽緩沖溶液中，用0.22 μm濾器抽濾，制成1 mg/mL的 P-15 多肽液。然后分別稀釋成 100、200、400 μg/mL各200 μL。在超凈工作臺內用分析天平稱取10 mg生物玻璃，置于24孔板的16孔內，均勻鋪開，然后滴加40 μg/mL 的多肽液 100、200、400 μg/mL 各 4 孔作為實驗組，另留4孔生物玻璃作為陰性對照組，4孔不加生物玻璃作為空白對照組。嚴密包扎孔板，置于150 r/min搖床中離心12 h，干燥后備用。第2代細胞生長匯合達80%以上時消化細胞，調整細胞懸液為2×105/mL-1，接種在已鋪好復合材料（生物玻璃/P-15）的24孔板內。分別于1、3、7、10 d檢測各組骨髓基質細胞ALP活性和考馬斯亮藍總蛋白含量，通過紫外分光光度儀檢測光密度值。

1.2.3 兔顱骨缺損模型制備及材料植入 將18只5月齡健康雄性大耳白兔適應性飼養1周，肌內注射速眠新通用名0.7 mL麻醉后固定于實驗臺，顱頂區常規消毒備皮，沿顱頂中線自眼眶后緣向頸根部做一3 cm直線切口，用剝離子分離骨膜。在距眼眶后緣、顱中縫0.5 cm處用裂鉆磨制1 cm×1 cm的全層骨缺損區[復合材料組（生物玻璃復合質量濃度為200μg/mL的P-15多肽）、陰性對照組（未復合P-15的生物玻璃）、空白對照組（不加生物玻璃）]，全程使用生理鹽水降溫。將預先準備好的材料植入缺損區，拉攏縫合骨膜以固定材料，縫合皮膚。術后視動物狀態酌情給予蘇醒藥物，并肌肉注射60萬U青霉素。材料植入4、6、8周后麻醉、處死動物，迅速完整取下眶部以上的顱骨部分。立即放入預先配好的4%多聚甲醛中固定。

1.2.4 組織學標本制作及染色 標本于4%多聚甲醛中固定24～48 h后沿冠狀面片切，用甲酸進行脫鈣1周。常規石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅染色（HE染色），封片觀察。改良Gomori染色：（1）常規脫蠟，天青石藍染液5 min；（2）水洗，常規HE染色用明礬蘇木精染液染細胞核，顯藍同HE染色；（3）用變色酸2R酸性復紅染色5～10 min；（4）用0.2% 醋酸水溶液洗 2～3次，肉眼觀察骨組織呈紅色，其他部分無色即可；（5）用亮綠染液復染；（6）用95%至無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。經此法染色后骨組織紅染，膠原纖維等礦化程度較低的組織綠染。

1.2.5 軟X射線檢查 采用GIOTTO鉬靶軟X射線攝片，將所攝X線片用數碼單反相機拍照，采用Image pro plus選取骨缺損區域，segmentation工具定義正常骨組織顏色，以排除未降解材料的影響，然后計算各組兔顱骨缺損X線片中骨缺損處成骨面積（area sum）。將4周空白對照組兔顱骨缺損area sum定義為1，對4、6、8周復合材料組兔顱骨缺損成骨面積與4周空白對照組的比值進行統計分析。

1.3 統計學處理 應用SPSS20.0統計軟件進行數據分析，計量資料以表示，組間比較采用多樣本均數單因素方差分析（one-wayANOVA）。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 復合材料對骨髓基質細胞ALP活性的影響 復合材料與骨髓基質細胞共培養后細胞排列具有一定方向性，呈魚群密集生長，材料周圍可見細胞緊密排列，平行或垂直于材料接觸面。實驗組骨髓基質細胞培養1 d后ALP活性即高于對照組，且質量濃度為200 μg/mL的實驗組骨髓基質細胞ALP活性培養1、4、7、10 d后均明顯高于質量濃度為100、400 μg/mL的實驗組及對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 復合材料對骨髓基質細胞ALP活性的影響

2.2 不同材料修復兔顱骨缺損的軟X射線分析 4周時復合材料組兔顱骨缺損區局部X射線阻射影面積較陰性對照組大，射區域之間高密度影像連接較廣泛，缺損處area sum明顯高于陰性對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。6周時復合材料組兔顱骨缺損區X射線阻射影密度較陰性對照組均勻，缺損處area sum明顯高于陰性對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），但仍可見未降解的材料和少部分低密度區域。8周時復合材料組兔顱骨缺損區X射線阻射面積明顯大于陰性對照組、空白對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 不同材料修復兔顱骨缺損的軟X射線分析

2.3 不同材料修復兔顱骨缺損的HE染色分析 4周時復合材料組兔顱骨缺損區復合材料周邊有新生骨小梁和部分纖維組織，周圍有少量炎癥細胞，骨細胞陷窩較多;材料中心已可見到細胞及類骨基質成分；材料之間有骨小梁連接。陰性對照組兔顱骨缺損區在生物玻璃周圍有薄層新骨形成，材料之間缺少骨組織的連接，由較多纖維組織包繞。6周時復合材料組兔顱骨缺損區復合材料中心骨基質沉積明顯，有細胞與周圍骨小梁相連接，但材料周圍新生骨的基質成分排列較紊亂；陰性對照組兔顱骨缺損區生物玻璃中心很少能觀察到細胞成分，但顆粒狀材料之間的骨組織比4周時明顯增多、增寬。8周時復合材料組兔顱骨缺損區復合材料中心有明顯骨樣組織沉積或可見梭形細胞呈網狀，周圍有成骨細胞緊密排列，形成的新骨可見板層樣結構；陰性對照組兔顱骨缺損區生物玻璃中心可見細胞及基質，顆粒狀材料之間新生骨組織較6周時繼續增多，但結構紊亂。見圖3。

圖3 不同材料修復兔顱骨缺損的HE染色分析（HE染色，200×）

2.4 不同材料修復兔顱骨缺損的改良Gomori染色分析 4周時復合材料組兔顱骨缺損區復合材料（無色或綠染）周邊有新生骨小梁形成，材料與顆粒之間及材料與正常骨組織之間緊密相連，但礦化程度不高；陰性對照組兔顱骨缺損區材料顆粒周圍可見纖維組織，之間僅有薄層低礦化組織相連。6周時復合材料組兔顱骨缺損區復合材料顆粒之間連接廣泛，有類似髓腔結構形成，部分材料中心可見礦化組織沉積明顯；陰性對照組兔顱骨缺損區材料之間彼此連接，但礦化程度稍低。見圖4。

圖4 不同材料修復兔顱骨缺損的改良Gomeri染色分析（Gomori染色，100×）

3 討 論

骨的有機成分中90%是由Ⅰ型膠原構成的，在其α1鏈上一段與間充質細胞結合且高度保守的15個氨基酸序列（766-GTPGPQGIAGQRGVV-780）被稱為P-15。其促進成骨原理是這15個氨基酸殘基組成的多肽能與成骨細胞前體細胞上的整合素受體結合，促進細胞黏附。因提供了更多的細胞結合位點，使整個修復過程從骨缺損灶內進行三維式的成骨，創造了一種有利于細胞各種生理活動和新骨生成的微環境，導致高度血管化的大量新骨生成。本研究結果顯示，生物玻璃復合P-15多肽后在植入6周時即可形成大量新骨，且材料內部形成類髓腔樣結構，提示有新生血管。

KüBLER等[8]將人成骨細胞分別接種于Bio-base?、Bio-Oss?、PepGen P-15?等骨替代材料，6、9 d 后測定不同組細胞活力和增殖情況，結果顯示，PepGen P-15組細胞線粒體脫氫酶活性最強。用相差倒置顯微鏡觀察，PepGen P-15組成骨細胞圍繞材料多層排列，且在顆粒之間形成橋連。掃描電鏡也證實了其他材料表面的細胞數量和層次均不及PepGen P-15[8]。

國內學者在制備胎牛骨無機骨基質（FABM）上培養了人頜骨間充質干細胞，結果發現，P-15能更有效地促進細胞與牛骨無機骨基質之間的黏附；在P-15對人頜骨間充質干細胞的彈性模量研究中發現，P-15改變了細胞膜彈性模量，從而影響了細胞黏附，表明多肽P-15可作為有效的促成骨生長因子用于骨粉表面修飾[9]。

本研究結果顯示，復合材料組骨髓基質細胞ALP活性較陰性對照組明顯增加；當復合的P-15多肽質量濃度為200 μg/mL時與復合材料共培養的骨髓基質細胞ALP活性明顯高于質量濃度為100、400 μg/mL的實驗組及陰性對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05），這種差異在接種后的前4 d尤為明顯，且細胞在復合材料周圍生長良好，排列規則。

本研究采用復合材料的主體為生物玻璃。生物玻璃是由鈉鹽、鈣鹽、磷酸鹽和二氧化硅組成的一類生物材料。當其與體液接觸時會誘發3個階段的反應，即擴散、溶出、凝集沉淀。最終通過縮聚反應和一系列重新排布形成了硅凝膠層[10]。該凝膠層具有較大的表面積，對蛋白多肽類具有一定吸附作用[11]。因此，本研究選擇生物玻璃作為P-15多肽的載體。本研究軟X射線結果顯示，復合材料組與陰性對照組比較，新骨形成面積較多，密度較均勻；組織學切片結果顯示，復合材料內部較早出現細胞成分，未降解顆粒之間有眾多骨小梁相連，骨細胞陷窩多見，新骨形成速度及礦化程度均優于陰性對照組。

鄧飛龍等[12]對P-15類材料的研究也證實了P-15多肽能將更多的細胞成分引入缺損處，從而加速新骨生成。另有動物實驗研究表明，PepGen P-15的早期骨修復能力強于Bio-Oss及Cerasorb[13]。國外學者的2項多中心實驗證明了PepGen P-15在治療牙周病骨缺損中的成骨效果[14]。但因體外與體內環境具有差異，本研究中細胞與材料的體外共培養篩選出的多肽質量濃度對體內實驗的指導意義具有局限性。

綜上所述，本研究通過體外細胞培養篩選出適宜成骨的P-15多肽質量濃度，與生物玻璃復合后植入兔顱骨缺損模型中經軟X射線分析和組織學檢查結果證實，復合材料的骨修復能力得到了一定的提高。本研究采用膠原仿生多肽來提高原有材料的成骨活性，希望能為骨替代材料的研究開辟思路。