山葡萄籽中原花青素的提取及其含量測定

桑雅麗，李曉春，王欣宇，王俊麗，劉 鑫，尚大勇

（赤峰學院，內蒙古 赤峰 024000）

1 前言

原花青素，是一種有著特殊分子結構的生物類黃酮.其結構是由不同數量的兒茶素、表兒茶素或沒食子酸經C4-C6或C4-C8鍵縮合而成[1].原花青素是目前國際上公認的清除人體內自由基最有效的天然抗氧化劑.葡萄中富含原花青素，尤其是在葡萄籽中達到ω(原花青素)≥5﹪的含量[2].作為世界上種植面積最大的水果，葡萄主要用于釀造葡萄酒，隨之產生的下腳料葡萄籽并未得到充分利用，因此葡萄籽中提取原花青素具有一定的經濟價值和積極意義.

目前對葡萄籽中提取原花青素的研究方法有很多，主要有超聲波輔助提取法、溶劑萃取法、微波輔助提取法、超臨界CO2提取法、離子液體輔助提取法、酶提取法等[3-9].比較常用的方法是超聲波輔助提取法和溶劑萃取法[10].超聲波輔助提取法具有提取效率高、提取時間短、提取溫度低、能保護有效成分及操作簡單易行等優點.而采用溶劑萃取法得到的原花青素純度較高，實驗成本較低，方法易于操作.

由于葡萄籽中原花青素的提取及其含量測定是一個綜合性的實驗，其中涉及了稱量、干燥、研磨、過濾、抽濾等系列基本操作，同時在實驗中受諸多因素影響，導致提取純度和測定含量會有所不同.本實驗采用超聲波輔助提取法和溶劑萃取法來提取葡萄籽中的原花青素，并對其含量進行了測定.通過對比找到適宜的實驗條件，并提供一定的借鑒作用.

2 實驗部分

2.1 儀器及試劑

儀器：恒溫水浴鍋（HH-Z，上海市宇隆儀器有限公司）、722N可見分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司）、電子天平（TP-214，北京賽多利斯儀器系統有限公司）、旋轉蒸發儀（上海申生科技有限公司）、超聲波清洗機（SB-5200 DTN，寧波新芝生物科技股份有限公司）、100目篩（上虞市滬江儀器廠）.

試劑：石油醚（60-90）（GB-AR 沸程60-90℃，西隴化工股份有限公司，批號20120115）.

丙酮（GB-AR 含量不少于99.5%，天津市富裕精細化工有限公司，批號20100905）.

無水乙醇（GB-AR 含量不少于99.7%，西隴化工股份有限公司，批號20120201）.

香草醛（HG-AR 含量不少于99.0%，天津市大茂化學試劑廠，批號20100504）.

甲醇（GB-AR 含量不少于99.5%，西隴化工股份有限公司，批號 20120101）.

原花青素標準品（GB-AR 含量不少于95%，上海市源葉生物科技有限公司，批號20100121）.

葡萄籽（取自內蒙古赤峰的山葡萄，用于釀酒后得到的廢棄葡萄籽）.

2.2 實驗原理

2.2.1 提取原理

超聲波輔助提取法（以下簡稱超聲波法）是利用超聲波的空化作用、機械效應和熱效應等加速有效物質的釋放、擴散和溶解，顯著提高提取效率的提取方法.超聲波在提取葡萄籽中原花青素方面的應用主要是和溶劑配合，使提取效率提高.溶劑萃取法一般是指從天然產物中提取有效部位的方法，根據天然產物中各種成分在溶劑中的溶解性，選用對活性成分溶解度大、對不需要溶出成分溶解度小的溶劑，而將有效成分從天然產物組織內溶解出來的方法.

由于葡萄籽中原花青素與蛋白質、多糖形成穩定的復合物，因此在提取時對溶劑有一定的要求.不僅要求溶劑對原花青素有良好的溶解性，還要對氫鍵有破壞作用.通常選用有機溶劑或含水的有機溶劑.而使用乙醇、丙酮等有機溶劑提取葡萄籽中的原花青素的同時，也能萃取脂肪油類，這就需要在提取之前必須先除去葡萄籽中的油脂.由于原花青素不溶于石油醚，因此沉淀過程常選用石油醚使原花青素沉淀下來.

2.2.2 含量測定原理

鹽酸-香草醛法測定原花青素的含量，其原理是基于原花青素A苯環（如圖1）化學活性較高，其上的間苯二酚或間苯三酚可與香草醛發生酚醛縮合反應，在濃酸的作用下，C-4位具有極強的親電性，其醇羥基與C-5、C-7上的酚羥基組成一個芐醇系統，使得4位碳易于生成紅色的正碳離子，此紅色的正碳離子由于含有p鍵的不飽和基團，所以可以吸收可見光，據此正碳離子的吸光度可測定原花青素的含量[11].

采用分光光度法在400-760nm范圍內對原花青素標準品進行紫外掃描測定其吸光度，并且以原花青素標準品配成標準系列溶液，測定吸光度并繪制標準曲線，根據標準曲線即可得到樣品中原花青素含量[12].使用鹽酸為催化劑，可以避免出現原花青素氧化分解的情況.

圖1 酚醛縮合反應機理

2.3 實驗步驟

2.3.1 超聲波法提取原花青素

將山葡萄籽倒入研缽中研磨，過100目篩，準確稱取5.0239g脫脂的山葡萄籽粉末于100mL小燒杯中，加入50mL石油醚，常溫浸泡48h，并用玻璃棒間歇攪拌.用布氏漏斗減壓抽濾，脫去溶劑和油脂.濾餅置于250mL三頸燒瓶中，加入100mL丙酮、無水乙醇或者純水，在25℃室溫下提取操作2h，全過程施加超聲波震蕩處理.用布氏漏斗減壓抽濾，并用少量溶劑洗滌濾餅3次，合并濾液和洗滌液置于250mL三頸燒瓶中，用旋轉蒸發儀濃縮成漿狀物后轉移至蒸發皿中，在60℃下烘干產品，粉碎后即為山葡萄籽提取物原花青素.稱量，計算提取率.

2.3.2 溶劑萃取法提取原花青素

將山葡萄籽倒入研缽中研磨，過100目篩，以石油醚（60-90）為溶劑，用索氏提取器抽提8h，待石油醚揮發后晾干備用.準確稱取5.0239g脫脂的山葡萄籽粉末，用無水乙醇為溶劑，料液比為1:7，于48.6℃水浴旋轉搖床上浸提3次，每次10min，過濾，并用浸提液洗滌殘渣，合并提取液.以酚酞為指示劑，用40%NaOH溶液滴定至溶液呈中性，過濾.采用旋轉蒸發儀于40℃、真空度為0.085MP條件下進行真空濃縮，將濃縮后的產品置于100mL小燒杯中，加入4倍體積的石油醚混合均勻后，將溶液靜置2h，過濾沉淀，置于烘干箱中烘干，得到低聚原花青素粗品.稱量，計算提取率.

2.3.3 原花青素的含量測定

配制試劑 A：1%香草醛溶液（稱取1.0000g香草醛溶于甲醇溶液中，定容至100mL）；B：8%的鹽酸液（取8.00mL濃鹽酸溶于甲醇中，定容至100mL）；顯色劑：A:B=1:1，現用現配.

最大吸收波長的確定 配制原花青素標準溶液，濃度為0.6mg/mL.取1.00mL于比色管中，加入5.00mL顯色劑，搖勻，避光.在30℃恒溫水浴中保持30min，取出比色管.以甲醇液為空白液，用722N可見分光光度計在350nm-700 nm之間確定最大波長.

標準曲線的繪制 分別取1.00、2.00、3.00、4.00、5.00mL原花青素標準液于10mL容量瓶中，然后用甲醇定容至10mL.各取1.00mL（另取1.00mL甲醇液為空白液）于比色管中，分別加入5.00mL顯色劑，搖勻，避光.在30℃恒溫水浴中保持30min，保溫比色.取出比色管，在500nm波長下，測定其吸光度，得到濃度及吸光度數據（見表4），并根據數據繪制標準曲線(見圖3).

原花青素的含量測定 分別準確稱取以超聲波法提取溶劑為丙酮、無水乙醇和純水的提取物及以溶劑萃取法提取出的提取物各0.5001g置于50mL小燒杯中，用適量甲醇溶液溶解轉移至50mL容量瓶，用甲醇定容至刻度.分別取1.00mL于比色管中，加入顯色劑，顯色分析.

3 實驗數據及結果

3.1 數據處理計算關系

超聲波提取法：

表1 超聲波法使用不同溶劑得到原花青素的提取數據

實驗結果表明：提取山葡萄籽中原花青素時不同溶劑對原花青素的提取率有一定的影響，由表1數據可知，分別以乙醇、丙酮和純水為溶劑提取時，純水的提取率最低，而乙醇的提取率最高.

溶劑萃取法：

表2 溶劑萃取法使用乙醇為溶劑得到原花青素的提取數據

表1和表2的實驗結果表明，室溫下以乙醇為溶劑的超聲波法提取原花青素提取率較高，而溶劑萃取法提取原花青素率則不及超聲波法效果好.

3.2 原花青素純度分析

原花青素標準品紫外掃描圖

表3 原花青素標準品紫外掃描數據

圖2 原花青素標準品紫外掃描曲線

由表3數據作圖（見圖2），得到原花青素標準品紫外掃描曲線：原花青素的最大吸收波長為500nm，因此確定鹽酸-香草醛法測定原花青素的波長為500nm.

原花青素標準曲線

表4 原花青素標準曲線數據

圖3 原花青素標準曲線

3.3 試樣中原花青素百分含量測定

超聲波法：

實驗測得以乙醇為溶劑的試樣原花青素的吸光度為0.137，根據原花青素標準曲線可得：試樣中原花青素濃度為0.125mg/mL，則試樣中所含原花青素的含量為12.50%；當提取溶劑為丙酮時，測得試樣原花青素的吸光度為0.109，根據原花青素標準曲線可得試樣中原花青素濃度為0.082mg/mL，則試樣中所含原花青素的含量為8.20%；當提取溶劑為純水時，測得試樣原花青素的吸光度為0.099，根據原花青素標準曲線可得試樣中原花青素濃度為0.075 mg/mL，則試樣中所含原花青素的含量是7.50%.

溶劑萃取法：

實驗測得以乙醇為溶劑的試樣原花青素的吸光度為0.125，根據原花青素標準曲線可得試樣中原花青素濃度為0.120mg/mL，則試樣中所含原花青素的含量為12.00%.

3.4 分析與討論

用山葡萄籽提取原花青素的實驗過程中，山葡萄籽的粉碎預處理對原花青素的提取率有一定的影響.須將山葡萄籽研磨的很細，然后將山葡萄籽分別過60和100目篩進行提取，過60目的山葡萄籽粉的提取物太少，無法進行后續實驗，因此100目是最適宜的處理方式.在用超聲波法提取原花青素的實驗過程中，以石油醚為溶劑脫脂時，須保持燒杯內的石油醚與外界空氣隔絕.因為石油醚易揮發，而山葡萄籽粉須用石油醚浸泡48h脫脂，所以要將燒杯口覆上保鮮膜以防石油醚揮發.使用旋轉蒸發儀蒸發溶劑時，一定要將溶液蒸發濃縮至漿狀物.使用溶劑萃取法提取原花青素時，第一步用索氏提取器脫去油脂，要注意回流時間和溫度的控制.因為高溫條件下，較長的反應時間可能會引起原花青素類物質的氧化，所以保持回流時間在8h即可，溫度控制在85℃.實驗過程中，需要中和乙醇，應該以酚酞作指示劑，用NaOH溶液滴定至中性.

4 實驗結論

本實驗采用超聲波輔助提取法和溶劑萃取法分別提取山葡萄籽中的原花青素，結果表明：以乙醇為溶劑，溫度在25℃時，使用超聲波輔助提取法時，5.0239g山葡萄籽可提取0.1785g原花青素，其提取率為3.55%，提取的原花青素純度為12.50%.比相同質量的山葡萄籽以溶劑萃取法提取得到的原花青素提取率和純度更高.同時，由于超聲波法所用時間較短，所用的溶劑乙醇價格低廉，易于購買.綜合考慮得出以乙醇為提取溶劑的超聲波輔助提取法更具優勢.