復元醒腦湯對糖尿病腦梗死大鼠BMECs的影響及microRNA-503的調控機制研究*

沈俊逸 方邦江 趙智明 劉春麗 壯雨雯 徐文俊 蔡 輝#

1 中國人民解放軍南京軍區南京總醫院 江蘇 南京 210002

2 上海中醫藥大學附屬龍華醫院 上海 200032

糖尿病并發腦梗死是糖尿病最常見的血管并發癥[1]。目前，糖尿病腦梗死的發病機制及有效防治成為國內外學者研究的重點與熱點。糖尿病腦梗死患者長期處于高血糖的狀態，微血管稀疏化、側枝化能力降低，梗死區域長期血供不足，神經功能恢復差。我們以往研究結果提示，糖尿病腦梗死大鼠基質細胞衍生因子1（stromal cell-derived factor-1，SDF-1）、CXC類趨化因子受體 4（C-X-C chemokine receptor type 4，CXCR4）表達下降，使得血管內皮祖細胞減少，其增殖、黏附、遷移能力降低，復元醒腦湯通過顯著上調糖尿病腦梗死大鼠缺血腦組織血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）蛋白的表達，可以促進血運的重建[2-3]。但在研究中我們對SDF-1/CXCR4軸信號通路進行阻斷后發現，缺血腦組織區域依然有部分血管新生和血運重建的發生，這提示糖尿病腦梗死后血管新生尚存在其他調控途徑和機制。腦梗死的發生發展、預后轉歸與糖尿病患者的血糖水平密切相關[4]。microRNAs是一種可以與其靶mRNA分子結合，抑制相關靶基因和蛋白表達的小RNA。研究證實，microRNA-503可以動態調節血糖的平衡，microR-503能夠通過與靶向的mRNA（CCNE1和CDC25A）互補配對，從而導致mRNA降解或翻譯抑制，microR-503不僅能夠直接調控胰島素分泌量、胰島發育、胰島β細胞的分化情況等，而且還可以調節胰島素在靶組織中的信號轉導及影響其功能的發揮，從而參與了對血糖的調節過程[5-6]。研究證實，通過上調細胞CCNE1和CDC25A蛋白，在一定程度上能夠抑制microR-503的表達，從而改善各種血管內皮細胞的功能，避免其損傷的反生，并且能夠幫助微血管網絡形成，保證血液的正常循環[7]。

本研究以糖尿病腦梗死腦皮質微血管內皮細胞（brain microvascalar endothelial cell，BMEC）為研究對象，觀察復元醒腦湯［人參（單煎）、三七、水蛭各10g，石菖蒲12g，益母草30g，生南星15g，制大黃（后下）9g，濃度388g/L］以及microR-503抑制劑對其干預前后對靶基因的影響以及對BMEC細胞遷移和成管能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料：分述如下。

1.1.1 實驗動物：20只健康雄性SD大鼠，體質量250g±25g，購自上海杰思捷實驗動物有限公司［動物合格證：SCXK(滬)2011-009］。

1.1.2 主要試劑及儀器：雙抗（P/S）、胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）和DMEM/F12培養基購買于美國Gibco公司；內皮細胞培養基（ECM，1001）購買于美國ScienCell公司；RNA抽提試劑（RNAiso Plus，9109）、反轉錄試劑盒（PrimeScript? RT Master Mix，RR036A）和實時熒光定量PCR試劑盒（SYBR?Premix Ex Taq?，RR420A）購買于Takara公司（大連寶生生物）；microRNA-503抑制劑、microRNA control抑制劑和Lipofectamine?RNAi MAX Transfection Reagent購買于Thermo Fisher scientific公司；結晶紫（C6158）、Ⅱ型膠原酶（C1764）、鏈脲佐菌素（STZ，S0130）和MTS試劑購買于美國sigma公司；Ⅷ因子子相關抗原(von willebrand factor，vwF)抗體購自美國Abcam公司(ab8822)；BD基質膠Matrigel購買于美國BD公司。酶標分析儀（美國Thermo Fisher scientific公司,Multiscan go型），實時熒光定量PCR擴增儀（美國Bio-Rad公司，CFX 96型），細胞培養箱（美國Thermo公司，311型）。

1.2 實驗方法：分述如下。

1.2.1 BMEC分離：取健康雄性SD大鼠20只，參照文獻[8]制備糖尿病腦梗死大鼠模型。即用STZ制備糖尿病模型，線栓法制備腦梗死模型，根據Berderson評分（≥1）確定造模成功[9]。造模成功后，3%的戊巴比妥鈉(0.1ml/100g)腹腔注射麻醉，頸椎脫臼法處死；75%乙醇浸泡5min消毒，打開顱腔取出完整腦組織，置于預冷的PBS液中，漂洗3次，加入1ml DMEM/F12培養液，將大腦皮質剪成體積約1mm3的小塊；加入0.1%Ⅱ型膠原酶，充分混勻后置于37℃水浴消化40min，1000g離心8min；取上清后加入20%BSA懸浮，充分混勻后1000g離心20min，將中上層神經組織和大血管去除，僅保留沉淀；加入Ⅱ型膠原酶2ml，懸浮并充分混勻后置于37℃水浴消化40min，1000g離心8min，去掉上清液加入20%BSA懸浮，充分混勻，1000g離心20min，收集微紅色的微血管段。

1.2.2 BMEC的培養和鑒定：以內皮細胞培養基(ECM+10%FBS+1%P/S)重懸，接種于25ml培養瓶中，置于37℃、5%C02的培養箱中培養，倒置顯微鏡下觀察細胞形態并拍照。細胞以2×105/ml接種于24孔板中，3天后倒掉培養基，PBS洗滌，4%多聚甲醛室溫固定30min，用BMEC特異性Ⅷ因子鑒定抗體vwF孵育細胞（1∶100稀釋）4℃過夜，室溫PBST洗3次，DAPI染核，倒置熒光顯微鏡下拍照。

1.2.3 空白血清和中藥血清制備：連續灌藥3天（根據臨床經驗，并依實驗動物與人體表面積比計算，每日按10.4g/kg/d，2次/d給以復元醒腦湯灌胃），第3天灌藥后1h，對灌藥大鼠取血，制備中藥血清；同時取未灌藥大鼠取血制備空白血清。除菌混合，滅活補體－20℃冰箱凍存備用。

1.2.4 BMEC轉染microRNA-503抑制劑：BMEC以3×105/孔鋪于6孔板，分別給予5%空白血清和5%中藥血清培養24h后，Lipofect RNAiMAX試劑盒轉染microRNA抑制劑control和microRNA-503抑制劑60 pmol?？偣?組，空白血清+抑制劑control對照組，空白血清+microRNA-503抑制劑，中藥血清+抑制劑control組，中藥血清+microRNA-503抑制劑組。

1.2.5 細胞遷移實驗：轉染24h后的BMECs消化計數后，以106個/ml的密度用無血清ECM培養基重懸，transwell小室加100μl細胞，下室加500μl含10%FBS及相應空白血清或中藥血清的DMEM。遷移16h后，24孔transwell小室用0.1%結晶紫+10%甲醇顯色20min后，顯微鏡下觀察拍照后，用500μl每孔33%醋酸洗脫結晶紫，酶標儀測OD560。

1.2.6 小管形成實驗：細胞轉染24h后，用質量分數為0.25%的胰酶消化，然后制成細胞懸液。將100μlatrigel加到培養皿中涂勻。混勻后立即加到培養器皿中（24孔板）。將培養器皿在室溫下放置25min，待膠凝固后，加入1×106BMEC細胞，轉移到37℃，5%CO2的培養箱中進行培養。

1.2.7 BMECs中microRNA-503、CDC25A、CCNE1、基因表達水平檢測：細胞轉染24h后，繼續培養48h，抽取RNA，反轉錄為cDNA，用于實時熒光定量PCR（Q-PCR）。引物序列如下：microRNA-503 F：CGCGGGATCGGGTCAGA，miR-503R：GGGAACATGTTGATCTCAG，U6 F：CTCGCTTCGGCAGCACA，U6 R:AACGCTTCACGAATTTGCGT，CDC25A F：GGGAATGAGCAGCCTCTTCTT，CDC25A R:ATCTCTACAAACCAGACCAGGG， CCNE1 F： ACAGCTAGCGCGGTGTAG， CCNE1R：GGACTTGGAACTCAGACCCG GAPDHF：ACTTTGGCATCGTGGAAGGG，GAPDH R：TGCAGGGATGATGTTCTGGG。PCR條件采用兩步法：98℃ 10s,58℃ 20s，40次循環。

1.3 統計學方法：所有實驗數據采用Graphpad prism 5統計軟件進行統計學分析，計量資料以均數±標準差（-x±s）表示，組間均數比較采用方差分析，方差分析P值小于或等于0.05，用LSD-t檢驗進行組間兩兩比較。

2 結果

2.1 BMEC的分離培養和鑒定：BMEC的培養情況具體見圖1A，BMEC（200×）：細胞的形狀呈短梭形，單層生長。高倍鏡下（圖1B）細胞形態更為清晰，細胞呈現梭形。通過Ⅷ因子相關抗原免疫熒光實驗（圖2），對照組陰性細胞沒有被染色（圖2A），陽性組（圖2B）可以觀察到實驗中培養的BMEC的胞漿及細胞核周呈現綠色著色，說明內皮細胞純度可達90%以上。根據BMEC的培養觀察，BMEC陽性純度效率、形態滿足實驗需要。

圖1 白光下BMEC細胞形態

圖2 BMECⅧ因子免疫熒光鑒定

2.2 復元醒腦湯治療的大鼠血清對BMECs中microRNA-503的表達影響：我們在細胞水平中，以miR-503i作為陽性對照，抑制microRNA-503的表達，通過定量PCR的表達檢測microRNA-503的表達量，觀察復元醒腦湯治療的大鼠血清是否可以有效抑制microRNA-503的表達，從而達到改善糖尿病腦梗死大鼠的治療效果。如表1所示，與microRNA control相比，microRNA-503抑制劑能明顯抑制microRNA-503的表達（P＜0.05）。2.3 復元醒腦湯具有促進BMECs的遷移能力：將BMEC細胞轉染microRNA抑制劑control、microRNA-503抑制劑24h后，重懸細胞，進行細胞遷移實驗。如圖3和表2顯示相對于空白血清對照組，復元醒腦湯中藥血清以及microRNA-503抑制劑組都可以明顯增強BMECs的遷移

能力（P＜0.05）。復元醒腦湯促進BMEC遷移能力，進一步說明了復元醒腦湯通過抑制microRNA-503的表達從而達到促進了BMEC的遷移能力。

表1 BMEC轉染microRNA-503抑制劑對microRNA-503表達的抑制作用（-x±s)

表2 酶標儀檢測中藥血清對BMEC遷移能力的影響（-x±s)

圖3 中藥血清對BMEC遷移能力的影響

2.4 復元醒腦湯中藥血清對BMECs中microRNA-503以及CCNE1和CDC25A基因表達的影響：如表3所示microRNA-503抑制劑和復元醒腦湯中藥血清都可以明顯上調CCNE1和CDC25A的基因表達（P＜0.05），從而抑制了microRNA-503的表達（P＜0.05）。然而復元醒腦湯中藥血清的抑制作用沒有microRNA-503抑制劑明顯。但是，microRNA-503抑制劑和復元醒腦湯中藥血清聯合刺激，可以更加明顯地抑制microRNA-503的表達（P＜0.05），復元醒腦湯對BMEC遷移和增殖的促進作用，是通過上調了CCNE1和CDC25A的表達，從而抑制了microRNA-503的表達，最終減輕了內皮細胞的損傷。

表3 復元醒腦湯中藥血清對BMEC中microRNA-503以及CCNE1、CDC25A基因表達的影響（-x±s)

2.5 復元醒腦湯中藥血清促進小管形成：我們利用BMEC進行小管形成實驗，對復元醒腦湯中藥血清在小管形成實驗的修復作用進行探討。如圖4A所示空白血清對照組的小管形成能力最弱；單純使用microRNA-503抑制劑（圖4B）或復元醒腦湯中藥血清（圖4C）對小管形成都有一定的促進作用；聯合使用miRNA-503抑制劑和復元醒腦湯中藥血清（圖4D）能明顯促進小管的形成。實驗說明，復元醒腦湯中藥血清可以通過促進小管形成從而促進血管損傷的恢復。

圖4 不同處理組對血管內皮細胞成管能力的影響

3 討論

在中醫學中，糖尿病合并腦梗死屬于消渴并發“中風”，消渴總結為燥熱為標、陰虛為本，中風總結為虛、風、火、氣、痰、血，主要表現為經絡瘀血、肝腎陰虛以及氣血阻滯。因此，此癥乃是因為燥熱、陰虛并存，煉液為痰，而使得經脈阻斷，心竅被蒙蔽所致。治療本病的原理在于以扶持元氣為根本，輔以化痰祛瘀、熄風泄熱、醒腦開竅。因此在腦梗死的治療手段上痰瘀的消除起到關鍵決定性的作用，是中醫治療中風的關鍵。自擬復元醒腦湯（人參、生天南星、石菖蒲、三七、水蛭、益母草、大黃）治療糖尿病腦梗死取得良好臨床療效。方中人參大補元氣；生天南星、石菖蒲豁痰瀉濁開竅，益母草、三七、水蛭活血逐瘀；大黃瀉熱涼血以熄風。前期我們對復元醒腦湯治療糖尿病腦梗死的作用機制進行了一些相關的實驗研究，結果表明復元醒腦湯改善糖尿病腦梗死患者神經缺損功能,具有保護血-腦屏障的作用，通過降低血-腦屏障的通透性，減輕腦水腫；通過降低糖尿病腦梗死的胰島素抵抗程度而改善胰島素敏感指數；復元醒腦湯能顯著提升腦組織中SDF-1、CXCR4、VEGF基因及蛋白的表達，促進腦梗死缺血區域的神經再生和微血管新生，改善缺血腦組織的血供和神經功能的恢復[10]。復元醒腦湯的作用機制是多靶點的，對復元醒腦湯多種作用機制的研究有利于更加明確其作用機制。

糖尿病發腦梗死病患者，血管組織在高血糖的狀態下受到很大的損傷，患者的梗死組織中微血管稀疏，側枝化能力低，梗死組織長期血供不足，神經功能恢復差[11]，而microRNA-503對血糖有很好的調節作用，同時對血管內皮細胞的功能恢復有重要作用。microRNA-503能夠通過與靶向的mRNA（CCNE1和CDC25A）互補配對，對基因表達進行負性調控，從而導致mRNA(CCNE1和CDC25A)降解或翻譯抑制。復元醒腦湯具有與microRNA-503抑制劑類似的治療效果。本研究解釋了復元醒腦湯在微血管內皮細胞中對microRNA-503相關信號通路的修復機制，豐富和發展了復元醒腦湯治療腦梗死的作用機制，為探索相關治療策略提出了一條新的路徑。

4 參考文獻

[1]KERNAN W N,VISCOLI C M，INZUCCHI S,et al.Pioglitazone improves insulin sensitivity among nondiabetic patients with a recent transient ischemic attack or ischemic stroke[J].Stroke，2003，34(6)：1431-1436．

[2]陳淼，王宏，方邦江.復元醒腦湯治療糖尿病合并腦梗死的機制研究[J].中國急救醫學，2013，33（7）：654-657．

[3]方邦江，周爽，沈俊逸，等.復元醒腦湯對糖尿病腦梗塞大鼠胰島素抵抗干預作用的實驗研究[J].成都醫學院學報，2012，7（3）：374-377．

[4]梁廣雄．糖尿病合并腦梗塞的中醫臨床治療探討[J]．中外健康文摘，2008，5(7)：159.

[5]Okuno S,Saito A,Hayashi T，et al.The c-Jun N-terminal protein kinase signaling pathway mediates Bax activation and subsequent neuronal apoptosis through interaction with Bim after transient focal cerebral ischemia[J].J Neurosci,2004,24(36)：7879-7887.[6]Wang ZQ,Wu DC,Huang FB,et al.Inhibition of MEK/ERK1/2 pathway reduces pro-inflammatory cytokine interleukin-1 expression in focal cerebral ischemia[J].Brain Res,2004,996(1)：55-66.

[7]Gu Z,Qian J,Zhang G.Extracellular signal-regulated kinase 1/2 activation in hippocampus after cerebralischemiamaynotinterferewithpostischemic cell death[J].Brain Res,2001,901(1)：79-84.

[8]楊翼萍，劉懷軍.絲裂原活化蛋白激酶在腦缺血損傷中的作用及其調控機制[J].中國臨床康復,2006,10(10)：138-42.

[9]Choi J S,Park HJ,KimHY,et al.Phosphorylation of PTEN and Akt in astrocytes of the rat hippocampus following transient forebrain ischemia[J].Cell Tissue Res,2005,319(3)：359-366.

[10]方邦江，周爽，沈俊逸，等.復元醒腦湯對糖尿病腦梗死大鼠腦組織血流量及含水量影響的實驗研究[J].老年醫學與保健，2012，18（6）：381-385．

[11]夏燕軍.自擬祛瘀湯為主治療腦梗死84例臨床觀察[J].浙江中醫雜志,2009,44(8)：590.