烏藥提取物對伴刀豆凝集素A致免疫性肝損傷小鼠保護(hù)作用的研究

潘建強 彭 昕

1 浙江省德清縣人民醫(yī)院 浙江 德清 313200

2 浙江醫(yī)藥高等專科學(xué)校 浙江 寧波 315100

免疫性肝損傷是由免疫反應(yīng)介導(dǎo)的肝實質(zhì)炎癥性病變，其重要特征是血清自身抗體陽性，肝組織內(nèi)有大量的炎癥細(xì)胞浸潤，從而導(dǎo)致肝臟損傷。免疫性肝損傷是肝纖維化、肝硬化甚至肝癌等肝臟疾病轉(zhuǎn)歸和發(fā)生發(fā)展的誘發(fā)因素。因此，積極治療免疫性肝損傷有著十分重要的意義。烏藥是一味具有行氣止痛、溫腎散寒功效的傳統(tǒng)中藥，近年來有研究發(fā)現(xiàn)，烏藥提取物可減輕急性酒精性肝損傷[1-2]。本文利用伴刀豆凝集素A（ConA）所致小鼠免疫性肝損傷模型，探討其對免疫性肝損傷的潛在功效，為拓展其臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑：聯(lián)苯雙酯滴丸購自浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠；伴刀豆凝集素A（ConA）購于美國Sigma公司；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、超氧化物歧化酶（SOD）、考馬斯亮藍(lán)試劑盒、丙二醛（MDA）檢測試劑盒均購自寧波航景生物科技有限公司；蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒、BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒均購自碧云天生物科技公司；腫瘤壞死因子（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司。

1.2 實驗動物：60只昆明種雄性SPF級小鼠，鼠齡7～8周，體重18±3g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司。每日12h照明，標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由飲水。保持飼養(yǎng)室溫、濕度分別為：25±2℃、（55±5）%。

1.3 藥品制備：烏藥藥材由浙江省天臺山烏藥生物工程有限公司提供，經(jīng)鑒定為樟科（Lauraceae）山胡椒屬（Lindera）植物烏藥Lindera aggregate（Sims）Kosterm的干燥塊根。將干燥烏藥藥材粉碎，稱取10g，分別用200、100ml的80%乙醇超聲提取2次，每次60min，合并兩次提取液，減壓旋轉(zhuǎn)濃縮至20ml，使提取液的濃度按生藥計為0.5g/ml。小鼠灌胃量10、5、1ml/kg則分別制得高、中、低劑量（按生藥計為5.0、2.5、0.5g/kg）。給藥劑量參考成人臨床常規(guī)用量確定。

1.4 分組與給藥：60只小鼠按每組10只，隨機分為6組，Ⅰ組為對照組（空白），Ⅱ組為肝損傷模型組，Ⅲ組為聯(lián)苯雙酯陽性藥物對照組，Ⅳ～Ⅵ組分別為烏藥低、中、高劑量治療組。連續(xù)給藥10天，每日1次，對照組和模型組灌胃給予等量生理鹽水，陽性藥物組給予聯(lián)苯雙酯溶液（0.10g/kg），低、中、高劑量組分別給予相應(yīng)濃度的提取物，末次給藥后4h造模，除對照組外，其他各組小鼠尾靜脈注射ConA 25mg/kg誘導(dǎo)ConA免疫性肝損傷模型[3]。

1.5 檢測指標(biāo)測定：造模8h后小鼠眼靜脈叢取血，全血在4℃、5000r/min，離心5min，取上層血清置4℃貯存?zhèn)溆茫瑱z測血清中ALT、AST、TNF-α活性。摘眼球取血后處死小鼠，并迅速分離肝、脾，稱取質(zhì)量，計算小鼠的肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)。小鼠肝臟指數(shù)=（肝質(zhì)量/體質(zhì)量）×100%，小鼠脾臟指數(shù)=（脾質(zhì)量/體質(zhì)量）×100%。取相同部位大小約0.3cm×0.3cm×0.3cm的肝組織，經(jīng)10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，HE染色，顯微鏡下比較各組病理組織的形態(tài)學(xué)變化差異；并采用比色法檢測肝組織勻漿中SOD、MDA的活性和含量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法：采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，各組數(shù)據(jù)以-x±s表示結(jié)果。組間采用One-way ANOVA方差分析，差異顯著水平為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 烏藥提取物對免疫性肝損傷小鼠肝臟、脾臟指數(shù)的影響：除對照組外，經(jīng)ConA誘導(dǎo)的其它各組小鼠肝臟出現(xiàn)不同程度的損傷，其中模型組的肝損傷最明顯，整肝呈現(xiàn)顆粒狀，與對照組相比，肝、脾明顯腫大，肝脾指數(shù)顯著升高（P＜0.05），其它各組的肝表面均有大小不同的壞死斑，表明造模成功。烏藥各劑量給藥組均能夠降低肝脾指數(shù)，中、高劑量組效果均達(dá)顯著水平（P＜0.05）。其中高劑量組抑制肝臟指數(shù)增大的效果與陽性藥物聯(lián)苯雙酯組相似，說明烏藥提取物能抑制肝臟、脾臟的增大，且呈一定的劑量相關(guān)性。見表1。

2.2 烏藥提取物對小鼠急性免疫性肝損傷肝組織病理學(xué)變化的影響：HE染色可見正常組小鼠肝臟組織細(xì)胞形態(tài)正常，未見明顯病理損傷，肝索及肝血竇排列規(guī)則，無炎性細(xì)胞浸潤。模型組肝小葉結(jié)構(gòu)模糊，肝索結(jié)構(gòu)消失，會管區(qū)有大量炎性細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞擴張并含有大量紅細(xì)胞，脂滴空泡，可見點狀壞死及小灶狀壞死。陽性藥物組和各給藥組均能不同程度地減輕肝臟受損程度。高劑量組肝索基本呈放射狀排列，肝竇結(jié)構(gòu)較清晰，肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常，肝細(xì)胞腫脹及炎性細(xì)胞浸潤與模型組相比有明顯改善。見圖1。

圖1 各組HE染色肝臟病理觀察（×40）

2.3 烏藥提取物對肝損傷小鼠血清相關(guān)指標(biāo)的影響：見表2。

表2 烏藥提取物對肝損傷小鼠血清相關(guān)指標(biāo)的影響（-x±s）

3 討論

ConA致小鼠肝損傷是常用的免疫性肝損傷模型。ConA主要效應(yīng)細(xì)胞有輔助性T細(xì)胞（Th）和巨噬細(xì)胞，進(jìn)入體內(nèi)后可激活肝竇內(nèi)的大量巨噬細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子直接損傷肝細(xì)胞，大量活化的T淋巴細(xì)胞可隨血流到達(dá)肝臟，或激活巨噬細(xì)胞使血管內(nèi)皮細(xì)胞被破壞，最終導(dǎo)致免疫性肝損傷[4]。MDA是自由基損傷機體不飽和脂肪酸形成的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，其含量高低往往與機體和細(xì)胞的受損程度成正比。SOD是機體抗氧化體系中起重要作用的一種含金屬離子酶，可通過催化超氧自由基的歧化反應(yīng)清除活性氧自由基，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)與功能完整性。由肝巨噬細(xì)胞分泌的TNF-α可誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡，并誘導(dǎo)多個調(diào)節(jié)免疫和炎癥過程的基因轉(zhuǎn)錄，是參與免疫性肝損傷的重要因素之一。ALT和AST是分布在肝細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的可溶性酶，肝臟受損后便釋放入血，因此血清ALT和AST水平高低常作為判定肝損傷程度的重要指標(biāo)。

本研究結(jié)果表明，烏藥各劑量給藥組均能夠降低肝、脾指數(shù)，中、高劑量組可使血清ALT、AST水平顯著降低，且變化趨勢與給藥濃度成正比。各劑量組的MDA和

TNF-α水平都顯著下降，高劑量組還可顯著提高SOD活性（P＜0.05），說明其可以通過提高肝細(xì)胞中抗氧化酶活性，抑制肝細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化等來降低免疫性肝損傷小鼠氧化應(yīng)激程度，從而改善肝損傷情況。由此可見，烏藥對ConA所致的免疫性肝損傷有較好的拮抗作用，為烏藥保肝藥效的進(jìn)一步開發(fā)利用奠定了相關(guān)實驗基礎(chǔ)。

4 參考文獻(xiàn)

[1]季夢漂，譚明明，王軍偉，等.烏藥不同提取物對急性酒精性肝損傷小鼠腸推進(jìn)率的影響[J].浙江中醫(yī)雜志，2017，52（9）：700-701.

[2]陳卓亮，王軍偉，譚明明，等.烏藥水提物與醇提物對急性酒精性肝損傷模型大鼠抗氧化作用的比較研究[J].浙江中醫(yī)雜志，2015，50（6）：414-415.

[3]鄭丹丹，姜楠，胡揚揚，等.雙孢菇胞內(nèi)和胞外多糖對伴刀豆凝集素A誘導(dǎo)免疫性肝損傷小鼠的保護(hù)作用[J].中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2017，31（4）：303-310.

[4]馬靜，姚廣濤.保肝藥效篩選方法及中藥保肝的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2016，22（23）：4671-4675.