廣西2個特色釀酒葡萄品種黃烷-3-醇組分解析

成 果，張 勁，黃小云，張 瑛，謝太理，謝林君，余 歡，周詠梅，周思泓

(廣西壯族自治區農業科學院葡萄與葡萄酒研究所，廣西 南寧 530007)

【研究意義】目前，我國釀酒葡萄生產中存在應用品種較為單一的問題，仍然以歐亞種葡萄‘赤霞珠’、‘霞多麗’等為主。而廣西屬亞熱帶氣候區，高溫多濕，歐亞種葡萄品種由于抗病性較差一直未在當地廣泛種植。南方野生葡萄品種耐高溫高濕，抗病性強，不易感染黑痘病、白腐病、炭疽病等病害，是重要的葡萄品種資源[1]。因此，挖掘廣西本地葡萄品種資源，提升特色釀酒葡萄品質至關重要?！厩叭搜芯窟M展】原花青素(Proanthocyanidins，Pas), 又稱為縮合單寧(Condnsed Tannins，CTs)，在植物體經苯丙烷-類黃酮代謝路徑合成，來源于葡萄果皮和種子，構成葡萄酒的‘骨架’，并保證酒的色澤穩定性[2-3]。原花青素是黃烷-3-醇(Flavan-3-ol)單元的聚合體，葡萄中常見的黃烷-3-醇單體有：兒茶素(Catechin, C)、表兒茶素(Epicatechin，EC)、表棓兒茶素(Epigallocatechin,EGC)和表兒茶素沒食子酸酯(Epicatechingallate，ECG)[4-5]。葡萄果實成熟過程中黃烷-3-醇組分含量發生變化。研究表明，不同葡萄品種單寧含量一般在坐果時達到最高，進入轉色期時含量開始下降[6]。不同品種、栽培條件、紫外線照射、激素處理等對葡萄果皮和種子中黃烷-3-醇物質的組成和含量有很大影響。前人研究表明，北美種群和歐美雜種葡萄中黃烷-3-醇含量最高，圓葉葡萄次之，而多數東亞種葡萄中黃烷-3-醇含量較低[7]。UV-C 能夠增強隱色花色素還原酶活性，從而誘導葡萄果實中黃烷-3-醇的合成[8]。劉金串等[9]研究表明，在幼果期對紅地球葡萄進行膨大處理可使果實總黃烷醇含量增加。高翔等[10]研究表明，油菜素內脂處理能夠提高‘赤霞珠’果皮及種子中的黃烷-3-醇含量?！颈狙芯壳腥朦c】近年來國內外學者不斷改進葡萄果實及葡萄酒中黃烷-3-醇類物質的檢測方法，并探究不同品種、不同產區葡萄及葡萄酒黃烷-3-醇類的組成及含量差異，而此類研究多集中于歐亞種葡萄。針對廣西特色釀酒葡萄品種‘凌豐’和‘桂葡6號’中黃烷-3-醇類物質組分特征的研究鮮見報道?！緮M解決的關鍵問題】以廣西特色釀酒葡萄品種‘凌豐’和‘桂葡6號’為試材，并與歐亞種‘赤霞珠’進行比較，通過檢測冬果不同發育期果皮和種子中黃烷-3-醇的含量，分析其組分特征，為今后優化廣西釀酒葡萄的栽培措施，提高當地特色釀酒葡萄的品質提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗地點與材料

試驗地位于廣西農業科學院葡萄與葡萄酒研究所科研基地(22°50′59′′ N，108°14′35′′ E)。供試的葡萄(VitisL.)品種為‘赤霞珠’(V.viniferaL.)、‘桂葡6號’(Vitissp.)以及‘凌豐’(V.quinquangularis×V.vinifera)，樹齡分別為8、3和10年。3個品種的整形方式分別為：單干雙臂型、一字型和Y字型，行距2.5 m，株距1.5 m，南北行向，灌溉方式均為滴灌。3個品種果實樣品均為冬果，采集時間始于花后4周(2015年9月28日)，之后每2周采樣1次至采收期結束。每個品種選擇樹體長勢基本一致的9株作為實驗樹，每3株合并作為一個生物學重復。每次采樣時間為上午9:00-10:00，樣品采后放入冰盒立即運回實驗室。

1.2 果實理化指標測定

從每個生物學重復的實驗樹上剪下100粒漿果果粒(即每個采樣點每個品種共300粒)，隨機兼顧果穗的各個部位。其中150粒樣品(每個生物學重復50粒)用于測定果實鮮重、單粒果皮鮮重、單粒種子數量、單粒種子鮮重、可溶性固形物含量和可滴定酸含量。詳細步驟如下：果實稱重后破碎擠汁，然后將果皮、果肉和種子分離，用濾紙吸去果汁后稱量果皮和種子鮮重，并統計種子的數量。利用PAL-1型手持折射計(Atago, Tokyo, Japan)測量可溶性固形物(Total soluble solids, TSS)含量。利用酸堿滴定法測定可滴定酸(Titratable Acid, TA)含量，結果用酒石酸表示。每個生物學重復采取3個技術重復測定。剩余樣品用液氮速凍后保存于-80 °C冰箱待用。

1.3 黃烷-3-醇類物質的檢測

黃烷-3-醇的提取方法參照Liang等[11]的方法。取0.1 g葡萄皮干粉或種子干粉于10 mL離心管中，加入1 mL間苯三酚緩沖液(含25.8 μl HCl和50 g/L 間苯三酚)和0.005 g抗壞血酸，在50 °C 下靜置裂解20 min后，加入1 mL乙酸鈉(200 mM)終止反應，離心15 min (10 000 r/min)后取出上清液置于新的10 mL離心管中；重復提取3次合并上清液搖勻，于-80 °C保存待用。每個生物學重復單獨提取。

采用島津LC-20AD高效液相色譜對提取產物進行檢測。流動相A：0.2 %乙酸水溶液。流動相B：乙腈∶0.2 %乙酸水溶液=4∶1。色譜條件如下，梯度洗脫程序：0～20 min，10 % B；20～30 min，10 %～15 % B；30～40 min，15 %～20 % B；40～50 min，20 %～33 % B；50～55 min，33 %～40 % B；55～58 min，40 %～100 % B；58～63 min，100 % B； 63～64 min，10 % B。流速：1.0 mL/min；柱溫：25 °C；檢測波長：280 nm；進樣量：25 μl。

1.4 葡萄果皮和種子中黃烷-3-醇類物質的定性與定量

本研究的黃烷-3-醇定性工作對標準品的保留時間一一確定。分別建立1～1000 mg/L之間、9個水平、3個重復的兒茶素、表兒茶素、表棓兒茶素和表兒茶素沒食子酸酯標準曲線，相關系數在0.97以上。果皮和種子中黃烷-3-醇含量單位為μg·漿果-1。

1.5 試劑與標樣

標準品：兒茶素[(+)-Catechin]、表兒茶素[(-)-Epicatechin]、表棓兒茶素[(-)-Epigallocatechin]和表兒茶素沒食子酸酯[(-)-Epicatechin gallate]均購買于 Sigma(St. Louis, MO, USA)公司，純度均為98 %以上。

色譜純試劑：乙腈(Acetonitrile)、甲醇(Methanol)和乙酸(Acetic acid)均購買于Fisher(Fairlawn, NJ, USA)公司，純度均達99.9 %以上。

分析純試劑：間苯三酚(Phloroglucinol)購買于上海瑞永生物科技有限公司；抗壞血酸(Ascorbate)購買于廣州金華大化學試劑有限公司；乙酸鈉購買于天津博迪化工股份有限公司；濃鹽酸(HCl)購買于廣東省廉江市愛廉化學試劑有限公司。

1.6 統計分析

利用獨立樣本T檢驗在P<0.05水平下進行顯著性分析。黃烷-3-醇含量為μg·漿果-1。采用SPSS 20.0進行數據處理，采用Excel 2010繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同品種果實理化指標隨發育期變化情況

由圖1可以看出，3個供試葡萄品種理化指標隨發育期的變化趨勢基本一致，但是含量高低和數量大小存在差異?！嘞贾椤汀柝S’葡萄果實于花后8周開始轉色，而‘桂葡6號’于花后10周進入轉色期。自花后6周起，‘桂葡6號’果粒鮮重和果皮鮮重高于‘赤霞珠’和‘凌豐’。采收期(花后14周，下同)，‘桂葡6號’果粒鮮重和果皮鮮重約為其它2個品種的2倍。花后6～14周，‘赤霞珠’平均每粒漿果中的種子數量低于‘凌豐’和‘桂葡6號’，且‘桂葡6號’平均每粒漿果中的種子重量高于‘赤霞珠’和‘凌豐’?；ê?～14周，‘桂葡6號’果實可溶性固形物濃度始終低于‘赤霞珠’和‘凌豐’?；ê?2～14周，‘凌豐’果實可溶性固形物濃度最高。花后4～8周，‘凌豐’果實可滴定酸含量最高，但在采收期‘桂葡6號’果實可滴定酸含量顯著高于其它2個品種。

不同小寫字母表示采收期不同品種之間差異達顯著性水平(P<0.05)Different small letters between different cultivars from harvest stage indicate significant differences at 5 % level(P< 0.05)圖1 不同品種果實發育期理化指標Fig.1 The physical and chemical characteristics of different cultivars changed with the grape development

圖2 不同品種葡萄果皮中黃烷-3-醇類物質含量變化Fig.2 Content of flavan-3-ols in grape skins of different cultivars

2.2 不同品種葡萄果皮黃烷-3-醇含量變化

如圖2所示，不同品種葡萄果皮中黃烷-3-醇含量隨發育期的變化趨勢不同。總體來說，3個品種葡萄果皮中表棓兒茶素的含量最高，其次是兒茶素和表兒茶素，表兒茶素沒食子酸酯的含量最低。自花后4周至采收期，‘桂葡6號’葡萄果皮中兒茶素的含量高于其它2個品種，且在花后6周時其含量達峰值，而‘赤霞珠’和‘凌豐’則是在花后8周時含量最高。3個品種葡萄果皮中表兒茶素含量隨發育期變化呈波動下降趨勢?；ê?周至采收期，‘凌豐’葡萄果皮中表兒茶素含量始終低于其它2個品種?；ê?2～14周，‘赤霞珠’葡萄果皮中表兒茶素含量最高?；ê?～12周，3個葡萄品種葡萄果皮中表棓兒茶素含量呈波動上升趨勢，但在采收期又略有下降。‘桂葡6號’葡萄果皮中表棓兒茶素含量始終高于其它另2個品種。在整個發育階段，‘凌豐’葡萄果實中表兒茶素沒食子酸酯含量最高，其次是‘桂葡6號’，‘赤霞珠’含量始終最低?！鹌?號’葡萄果皮中表兒茶素沒食子酸酯含量在整個發育階段呈上升趨勢，而‘赤霞珠’和‘凌豐’其含量自花后4～12周不斷增加，到采收期略有降低。

2.3 不同品種葡萄種子黃烷-3-醇含量變化

如圖3所示，不同品種葡萄種子中黃烷-3-醇含量隨發育期的變化趨勢也存在差異?？傮w來說，3個品種葡萄種子中表棓兒茶素的含量最高，其次是表兒茶素，再次是兒茶素，表兒茶素沒食子酸酯的含量最低。自花后4周至采收期，3個品種葡萄種子中兒茶素含量在波動中下降，采收期含量降至最低，‘赤霞珠’種子中兒茶素含量自花后10周起高于其它2個品種?；ê?周，‘桂葡6號’種子中表兒茶素含量最高，而‘赤霞珠’和‘凌豐’種子中表兒茶素含量在花后6周達峰值后在波動中下降。采收期‘赤霞珠’種子中表兒茶素含量高于‘桂葡6號’和‘凌豐’。3個品種葡萄種子中表棓兒茶素含量隨發育期的變化趨勢一致，且都在花后6周時含量最高，隨后持續降低?；ê?～10周，‘桂葡6號’種子中表棓兒茶素含量最高，采收期時‘凌豐’種子中表棓兒茶素含量低于其它2個品種?；ê?周時，‘桂葡6號’種子中表兒茶素沒食子酸酯含量最高，而‘赤霞珠’和‘凌豐’種子中其含量在花后6周達峰值?；ê?～14周，‘桂葡6號’種子中表兒茶素沒食子酸酯含量最低，采收期‘赤霞珠’中其含量高于其它2個品種。

圖3 不同品種葡萄種子中黃烷-3-醇類物質含量變化Fig.3 Content of flavan-3-ols in grape seeds of different cultivars

2.4 不同品種葡萄果皮及種子黃烷-3-醇總量及比例變化

由圖4可以看出，3個品種葡萄果皮中黃烷-3-醇總量在花后12周達峰值，且整個發育階段‘桂葡6號’果皮中黃烷-3-醇總量顯著高于‘赤霞珠’和‘凌豐’，漿果成熟后期(花后12～14周)‘赤霞珠’和‘凌豐’之間差異不顯著。3個品種葡萄種子中黃烷-3-醇總量隨發育期的變化趨勢與果皮不同?！嘞贾椤汀柝S’種子中黃烷-3-醇在花后4周含量最高，而‘桂葡6號’則是在花后6周達峰值。進入轉色期后，3個品種葡萄種子中黃烷-3-醇總量持續降低，且‘凌豐’種子中黃烷-3-醇總量顯著低于‘桂葡6號’和‘赤霞珠’。將黃烷-3-醇按其B環羥基化程度不同分類，可分為3′5′-羥基化和3′-羥基化2種。本研究結果表明，3個品種葡萄果皮中所含有的黃烷-3-醇以3′5′-羥基化修飾為主，且3′5′-羥基化黃烷-3-醇比例隨發育期呈波動上升趨勢，而3′-羥基化黃烷-3-醇比例持續降低?；ê?2～14周，‘赤霞珠’果皮中3′5′-羥基化黃烷-3-醇比例顯著低于‘凌豐’和‘桂葡6號’。花后4周，3個品種葡萄種子中所含的黃烷-3-醇以3′-羥基化修飾為主，隨后3′5′-羥基化修飾比例急劇增加，到采收期為止，其所占比例>50 %?；ê?～14周，‘桂葡6號’葡萄種子中3′5′-羥基化黃烷-3-醇比例顯著高于‘赤霞珠’和‘凌豐’。果實成熟階段(花后10～14周)，‘赤霞珠’葡萄種子中3′-羥基化黃烷-3-醇比例顯著高于其它2個品種。

3 討 論

葡萄果實中常見的黃烷-3-醇類物質有兒茶素、表兒茶素、表棓兒茶素和表兒茶素沒食子酸酯4類，它們存在于果實的果皮、種子、果梗、果肉及枝條中[12-13]。本研究對‘赤霞珠’、‘凌豐’和‘桂葡6號’不同發育期理化指標的檢測結果表明，野生資源選育的品種‘桂葡6號’單粒漿果的果皮重量和種子重量高于其它2個品種，而葡萄皮和種子所含的黃烷-3-醇類物質為葡萄及葡萄酒的酚類物質的主要來源，因此野生資源選育的‘桂葡6號’酚類物質含量豐富。

不同品種葡萄中黃烷-3-醇物質的含量有很大差異。Jin[14]對9個紅色釀酒葡萄果皮中的酚類物質的檢測結果表明，‘西拉’、‘蛇龍珠’‘赤霞珠’、‘美樂’和‘煙73’果皮中的黃烷-3-醇總量顯著高于‘佳美’和‘黑比諾’。Zhu[15]對6個種群的23個葡萄品種果皮中的黃烷-3-醇類物質的檢測結果發現，北美種群的‘尼亞加拉’果皮中黃烷-3-醇總量最高，約為歐亞種‘赤霞珠’的20倍左右。在本研究中，野生資源選育的‘桂葡6號’葡萄果皮中黃烷-3-醇總量顯著高于歐亞種‘赤霞珠’和毛歐雜種‘凌豐’。張娟等[16]對20個紅色釀酒品種葡萄種子中黃烷-3-醇類物質的檢測結果表明，‘沃波爾特’、‘法國蘭’和‘粉紅沙斯拉’3個品種籽中黃烷-3-醇總量最高，‘美樂’、‘灰比諾’、‘赤霞珠’和‘佳麗釀’等品種次之；‘黑虎香’、‘北醇’、‘神索’和‘蛇龍珠’最低。在本研究中，果實成熟階段‘凌豐’種子中黃烷-3-醇總量顯著低于‘赤霞珠’和‘桂葡6號’。黃烷醇類物質除了決定葡萄酒的苦味及澀味以外，還對葡萄酒顏色具有保護作用[17]，由葡萄果皮及種子中經發酵過程進入葡萄酒中。因此，廣西本地野生資源選育的‘桂葡6號’在黃烷-3-醇對葡萄酒的護色方面具有很大潛力。

不同小寫字母表示同一發育期，不同品種之間差異達顯著性水平(P<0.05)Different small letters between different cultivars from the same developmental stage indicate significant differences at 5 % level(P < 0.05)圖4 不同品種黃烷-3-醇總量與3′5′/3′-羥基取代黃烷-3-醇比例Fig.4 The ratio of tri-/di-hydroxylated flavan-3-ols and flavan-3-ol total content in different grape cultivars

已有大量文獻對葡萄生長發育過程中黃烷-3-醇類物質的變化進行了報道，它們在果實的不同發育階段和不同部位進行合成[17]。葡萄果皮中的黃烷-3-醇在轉色后1～2周達到最大值，隨后呈急劇降低趨勢，主要原因是轉色后類黃酮代謝路徑上的底物更多的流向合成花色苷的方向[18,19]。在本研究中，‘赤霞珠’、‘凌豐’和‘桂葡6號’果皮中黃烷-3-醇含量都在花后12周出現峰值，這主要取決于果皮中含量最高的表棓兒茶素的變化趨勢。在葡萄種子中，黃烷-3-醇在果實轉色前完成積累，轉色后到成熟此類物質的含量有明顯下降，主要原因是氧化作用[20-21]。在本研究中，3個品種葡萄種子中黃烷-3-醇總量都在轉色前達到峰值，‘赤霞珠’和‘凌豐’種子中黃烷-3-醇總量在花后4周最高，而‘桂葡6號’中其最大值則出現在花后6周。由此可見，不同葡萄品種果皮和種子中黃烷-3-醇隨發育期的積累和變化規律存在差異，這對于其生物學性狀的描述和釀酒品質的評價具有重要意義。

表兒茶素與兒茶素雖然只是在C3位的構象不同，但卻有截然不同的口感，表兒茶素比兒茶素更加苦澀而且苦澀的感覺持續的時間也更長[22]。果實成熟階段，‘赤霞珠’果皮和種子中表兒茶素含量高于‘桂葡6號’和‘凌豐’，說明其苦澀感比其它2個品種更強。

在植物體內，原花色素由黃烷-3-醇單體聚合而成。原花色素結構多變，這主要是黃烷醇的修飾類型、化學異構以及聚合度的變化造成的[17]。黃烷-3-醇B環羥基化模式取決于細胞色素P450單加氧酶F3′H和F3′5′H的催化，由F3′H催化產生的二羥基化(3′-羥基取代)黃烷-3-醇主要有兒茶素和表兒茶素；由F3′5′H催化產生的三羥基化(3′5′-羥基取代)黃烷-3-醇主要有棓兒茶素和表棓兒茶素。果實成熟后期，‘凌豐’和‘桂葡6號’葡萄果皮中3′5′-羥基取代黃烷-3-醇比例高于‘赤霞珠’，而整個發育期‘桂葡6號’種子中3′5′-羥基取代黃烷-3-醇比例顯著高于其它2個品種。另外，黃烷-3-醇C3位的羥基基團容易被沒食子酸酯化，這類酯化的黃烷-3-醇大量存在于葡萄籽中。沒食子酸酯化使酒的單寧感變粗糙，而三羥基化黃烷醇能夠降低這種粗糙的口感，柔順酒體[23-25]。由以上分析可以看出，‘桂葡6號’果實中高比例的3′5′-羥基取代黃烷-3-醇有助于提高葡萄酒的柔順度。

4 結 論

葡萄果皮和種子中黃烷-3-醇總量、兒茶素、表兒茶素、表棓兒茶素及表兒茶素沒食子酸酯含量隨發育期的變化趨勢在不同品種間存在差異影響。廣西特色釀酒葡萄品種‘桂葡6號’和‘凌豐’葡萄果皮和種子中黃烷-3-醇含量最高的一類是表棓兒茶素。漿果成熟后期‘凌豐’種子中黃烷-3-醇總量顯著低于‘桂葡6號’和‘赤霞珠’。野生資源選育的‘桂葡6號’果皮和種子中黃烷-3-醇含量和3′5′-羥基取代黃烷-3-醇的比例較高，是極具發展潛力的紅色釀酒品種。