基于RIL群體的烤煙烘烤特性遺傳分析

張玉琴，孫 陽，王傳義，李青山，劉要旭，徐秀紅*

(1. 中國農業科學院煙草研究所，農業部煙草生物學與加工重點實驗室，山東 青島 266101；2. 中國農業科學院研究生院，北京 100081)

【研究意義】烘烤特性是指煙葉在烘烤過程中表現出的變黃和脫水的速度及同步程度，變黃后是否容易定色等特性，包括易烤性和耐烤性[1]。容易變黃，變黃和脫水協調的煙葉易烤性好，反之易烤性差。葉片變黃快且維持不變褐的時間越長，其耐烤性越好，烘烤特性越好[2]。研究烤煙烘烤特性的遺傳基礎可以為選育烘烤特性好的品種和提高烤煙烘烤品質提供理論基礎，對煙草品質育種具有一定的指導意義。【前人研究進展】煙葉烘烤從外觀看是葉綠素等色素降解的反映，藤田茂隆等[3]以單倍體加倍系為研究材料，提出用變黃指數來指示煙葉的易變黃性，揭示了烤煙易烤性很可能受一個主效基因控制，并發現易烤性與生物堿含量密切相關。另有研究[4-5]表明烤煙耐烤性與多酚氧化酶活性密切相關，多酚氧化酶的差異特性主要取決于品種和栽培條件。性狀間的連鎖證明煙葉烘烤特性受遺傳影響[3,6-7]。近幾年國外對烤煙烘烤特性的研究報道較少，國內對烘烤特性的遺傳研究有所加強。中國農業科學院煙草研究所利用烤煙組合的四世代(P1、P2、F1、F2)及六世代群體(P1、P2、F1、F2、B1、B2)，初步揭示了烤煙烘烤特性的遺傳規律，用SSR分子標記構建遺傳圖譜，初步定位了與烘烤特性相關的QTL位點[8-10]。D.Gong等[11]結合SLAF-Seq開發的SNP標記與公布的煙草基因組SSR分子標記[12-13]構建烤煙分子遺傳連鎖圖譜，發現了2個易烤性主效QTL并將其定位到了煙草基因組的第6個連鎖群上。

植物數量性狀的主基因+多基因混合遺傳模型廣泛應用于水稻[14]、小麥[15]、玉 米[16]、黃瓜[17]、棉花[18]、煙草[19-21]等糧食、蔬菜和經濟作物。利用重組自交系對烤煙烘烤特性進行遺傳分析的研究尚未有報道。【本研究切入點】本研究以烤煙品種云煙85和大白筋599構建的重組自交系群體為試驗材料，利用“主基因+多基因”的植物數量性狀遺傳分析方法，對烤煙易烤性、耐烤性的遺傳規律進行研究。【擬解決的關鍵問題】為烤煙烘烤特性QTL精細定位及應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗采用烘烤特性好的烤煙品種云煙85作為母本(P1)，烘烤特性差的大白筋599作為父本(P2)，從F1單株上收取自交種子，單粒傳法獲得F2∶7代重組自交系。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計 2016年在中國農業科學院煙草研究所青島試驗基地種植168個F2∶7代重組自交系。試驗地土壤類型為棕壤，偏砂質土。年平均降雨量750 mm，年平均氣溫12 ℃。試驗地土壤肥力狀況：堿解氮59.45 mg/kg，有效磷23.60 mg/kg，速效鉀106.33 mg/kg，有機質含量0.97 %，pH5.29，氯離子6.80 mg/kg。煙田行距1.2 m，株距0.5 m，留葉數20片，按照優質煙生產要求進行田間管理。試驗按照完全隨機區組設計，設3個重復。RIL家系每小區種植10株，共30株，親本每小區種植20株，共60株。待到中部煙葉(10～11葉位)成熟后，RIL家系的每個重復取5片調查烘烤特性，親本的每個重復取10片調查烘烤特性。

1.2.2 烘烤特性調查方法 采用煙葉成熟期暗箱試驗[1]作為烘烤特性的測定指標。待煙葉成熟后，將其掛在保持室溫的暗箱中，每24 h記錄1次變黃比例和變褐比例，累計測9次。取24、48、72、96 h的變黃面積計算變黃指數(YI)，YI=ΣY/n，Y表示每次的黃色面積比例，n表示測量次數。變黃指數越大，表示易烤性越好。從開始變褐進行變褐面積統計，變褐指數BI=ΣB/n，B表示變褐指數，n表示測量次數。變褐指數越小，表示耐烤性越好。

1.3 數據分析

方差分析采用SPSS 23.0，頻率分布和曲線擬合采用Origin軟件。遺傳數據采用主基因+多基因的植物數量性狀混合遺傳模型分析。

2 結果與分析

2.1 親本及RIL群體烘烤特性的表型結果

2.1.1 烘烤特性指標的方差分析 從表1可知，變黃指數在親本間存在高度統計學意義，在親本內重復間無統計學意義(P1=0.9065，P2=0.9174)。變褐指數在親本間有高度統計學意義，在親本內重復間無統計學意義(P1=0.9922，P2=0.8696)，說明親本在易烤性、耐烤性性狀上存在真實有效的遺傳差異。偏度和峰度的絕對值均少于1，說明變黃指數和變褐指數在親本內的分布均服從正態分布，符合數量性狀的分布要求[22]。RIL家系間變黃和變褐指數均具有高度統計學意義(P=0.0001)，說明烤煙烘烤特性在家系間存在穩定的遺傳差異，可以進行數量性狀的遺傳分析。

表1 父母本及重組自交系烘烤特性指標分析

注：同行標有A、B者表示親本間差異有高度統計學意義(P<0.01)。

Note：The same lines label A and B indicate a statistically significant difference between the parents (P<0.01).

Y:變黃指數；B:變褐指數圖1 變黃指數、變褐指數在重組自交系群體中的次數分布Fig.1 Frequency distribution of yellow index and browning index in RILs population

2.1.2 RIL群體烘烤特性指標的頻率分布 由圖1可以看出變黃指數和變褐指數在RIL群體中呈現連續分離，且均出現超親現象，說明烘烤特性受多基因遺傳或基因互作的影響。擬合曲線呈現單峰明顯的偏態分布，說明易烤性、耐烤性的遺傳可能受主基因控制。

2.2 烘烤特性最優模型選擇與檢驗

2.2.2 耐烤性遺傳模型 通過IECM算法獲得烤煙耐烤性RIL群體5類38種遺傳模型的AIC值。根據AIC準則，4MG-AI、MX2-AI-AI、MX2-AI-A、MX3-AI-A 4種模型的AIC值較小，可作為備選模型(表2)。依據統計量的適合性檢驗，發現在P1、P2和RIL的15個檢驗統計量中，4個模型中有統計學意義的統計量個數分別為5、4、4、4。綜合確定耐烤性最優遺傳模型為MX2-AI-AI，即2對加性-上位性主基因+加性-上位性多基因模型(表3)。

表2 重組自交系群體烘烤特性指標不同遺傳模型的AIC值

續表2 Continued table 2

模型Model變黃指數Yellowing index變褐指數Browning index模型Model變黃指數Yellowing index變褐指數Browning indexPG-AI1861.6511497.148MX3-AI-A1865.8521489.201PG-A1912.1421542.395MX3-A-A1924.4111649.236MX1-A-AI1863.6561499.152MX3-CEA-A1870.9811544.192MX1-A-A1880.2291544.278MX3-PEA-A1937.7811647.724MX2-AI-AI1860.7571487.8544MG-AI1837.7121477.084MX2-AI-A1859.2111488.2084MG-CEA1953.8721583.833MX2-A-A1882.1851546.2314MG-EEA1864.7811542.701MX2-EA-A1865.5951542.9864MG-EEEA1894.3161502.748

注:帶下劃線的數字表示備選模型對應的AIC值。

Note:The numbers with underline refer to the AIC values for the candidate genetic models.MG=major gene model, MX=mixed major gene and polygene model,PG=polygene model, A=additive effect, I=interaction (epistasis), E=equal, C=completely, P=partly.

表3 烘烤特性指標備選模型的適合性檢驗

2.3 烘烤特性的遺傳效應分析

2.3.1 易烤性的遺傳效應分析 通過對RIL群體變黃指數的分析得出，云煙85×大白筋599組合的易烤性受4對加性-上位性主基因控制，第1、2對主基因的遺傳效應較大，分別為12.89、8.80，易烤性增加的效應來源于母本云煙85。第4對主基因的加性效應和基因間的互作效應均為負值，第3、4對主基因間的互作效應較小，其余主基因之間的互作效應明顯，主基因遺傳率達到95.98 %(表4)。

表4 烘烤特性指標的模型遺傳參數

2.3.2 耐烤性的遺傳效應分析 對RIL群體變褐指數的遺傳分析得出，烤煙組合的耐烤性受2對加性-上位性主基因+加性-上位性多基因控制，2對主基因的加性效應均為負值，不耐烤的效應來源于父本大白筋599，主基因間的互作為正向效應，主基因遺傳率為54.26 %，多基因的遺傳率為17.82 %，主基因加多基因的遺傳率為72.08 %(表4)。

3 討 論

RIL群體烘烤特性的遺傳分析表明易烤性的遺傳符合4對加性-上位性主基因模型，遺傳效應以第1、2對主基因的加性效應為主，易烤性增加的效應來源于母本云煙85，主基因遺傳率很高，有利于QTL位點的發掘和應用。譚效磊[8]通過SSR分子標記技術構建遺傳圖譜并進行QTL定位，發現4個與易烤性相關的QTL，均為正向加性效應，可解釋的表型變異范圍為7.57 %～9.26 %。D.Gong等[11]利用F2、F2∶3群體的表型結果，定位到2個共同的易烤性主效QTL，可解釋的表型變異率分別為19.3 %～27.3 %、15.2 %～25.1 %，并將其定位在煙草基因組的第6個連鎖群上。

RIL群體的耐烤性遺傳符合2對加性-上位性主基因+加性-上位性多基因模型，主基因均為負向加性效應，基因間互作效應明顯，主基因遺傳率達到54.26 %。郝賢偉[10]用聯合分離分析方法，分析控制烤煙耐烤性遺傳的主基因以負向加性效應為主，主基因之間有明顯的互作效應，并利用200個F2群體定位到2個分別位于第3和第9連鎖群的耐烤性相關主效QTL，可解釋的耐烤性變異率分別為47.01 %和17.49 %，這與RIL群體耐烤性的遺傳分析結果基本一致。王春凱等[23]基于全基因組關聯分析對烤煙烘烤特性位點進行發掘，并對重要關聯區段進行基因篩選和分析，初步預測了4個與易烤性相關的基因和1個與耐烤性相關的基因。

烤煙烘烤特性的遺傳分析表明易烤性和耐烤性主要受2對主效基因的控制，這與前人的研究結果[8-11]整體一致，又不盡相同。造成結果差異的原因主要有兩方面：一方面數量性狀的遺傳往往比較復雜，影響烘烤特性的因素較多，所以烘烤特性的遺傳也不例外。另一方面，試驗群體和模型的不同也會對具體結果造成影響[24]。本研究基于RIL永久群體，采用拓展到4對主基因的數量性狀“主基因+多基因”遺傳分析方法[25]分析烘烤特性的遺傳效應，有利于發掘更多的主基因，提供更多的遺傳參數。且RIL群體的不同家系經過重組，基因型得到了固定，這種永久性的分離群體是構建遺傳連鎖圖譜和QTL定位研究的理想材料[26-27]。利用RIL群體進行烤煙烘烤特性的遺傳分析，不需考慮基因的顯性效應，有利于對控制數量性狀基因的加性效應和上位性效應進行估計，為烘烤特性QTL定位提供理論依據。今后，應在已有研究基礎上，利用RIL群體和高通量測序技術對烘烤特性QTL進行精細定位，結合最新煙草基因組測序數據，研究將主效QTL定位到相應染色體區段上，進行基因的標記輔助選擇和分離克隆。

4 結 論

利用RIL群體對烤煙烘烤特性進行遺傳分析，結果表明烤煙易烤性的遺傳符合4對加性-上位性主基因模型，主基因遺傳率達到95.98 %。耐烤性的遺傳符合2對加性上位性主基因+加性上位性多基因模型，主基因之間互作效應明顯，主基因遺傳率為54.26 %，多基因的遺傳率為17.82 %。