廣西凡納濱對蝦源副溶血弧菌耐藥性和耐藥基因的檢測

黃偉德，肖雙燕，黎姍梅，黃德生，張振豪，鐘昌艷，陳福彩，梁 毅，梁靜真*，黃 鈞*

(1. 廣西水生動物病害診斷實驗室, 廣西 南寧 530005；2. 欽州市水產(chǎn)技術推廣站, 廣西 欽州 535000；3. 廣西大學 動物科學技術學院, 廣西 南寧 530005；4. 廣西水產(chǎn)技術推廣總站, 廣西 南寧 530022；5. 北海市合浦縣水產(chǎn)技術推廣站, 廣西 北海 536100；6. 防城港市港口區(qū)漁業(yè)技術推廣站, 廣西 防城港 538002；7. 欽州市欽南區(qū)水產(chǎn)技術推廣站，廣西 欽州 535000；8. 東興市漁業(yè)技術推廣站，廣西 東興 538100)

【研究意義】凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)又稱南美白對蝦，具有出肉率高、營養(yǎng)需求低、生長迅速、適應性強等優(yōu)點。從1996年引進廣西后，一直是廣西沿海重要的對蝦養(yǎng)殖品種。而近年來細菌性疾病常給廣大養(yǎng)殖戶造成巨大的損失，已成為制約廣西凡納濱對蝦養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展的重要因素。副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)為革蘭氏陰性菌，主要分布于淡咸水交界處、沿海以及魚蝦貝類等多種水產(chǎn)動物中，能引起對蝦的爛鰓病、紅體病、早期死亡綜合征等多種疾病，是限制我國海水對蝦養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的主要病原菌之一[1-3]。目前對弧菌病主要以抗生素進行治療。但隨著抗生素的大量使用，副溶血弧菌耐藥問題日漸突出，必需引起養(yǎng)殖及疾病防治工作者的高度重視。此外，副溶血弧菌還是夏秋季節(jié)沿海地區(qū)食物中毒和急性腹瀉的主要病原菌[4]。可見副溶血弧菌病的流行不僅嚴重影響凡納濱對蝦養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，還對人類健康與食品安全造成很大威脅。因此，深入探討副溶血弧菌的耐藥性及其機制，無論是對凡納濱對蝦弧菌病防控提供指導還是對人類的公共健康都顯得非常迫切。【前人研究進展】有關副溶血弧菌的耐藥性研究目前已有不少報道，如Oh等[5]和Yutaka等[6]分別對韓國魚源和泰國蝦源副溶血弧菌的耐藥性進行了研究；國內(nèi)眾多學者也先后對浙江[7]、江蘇[8]、福建和海南[9]等地水產(chǎn)品源副溶血弧菌的耐藥表型進行了研究，并發(fā)現(xiàn)部分菌株在一定程度上產(chǎn)生了多重耐藥性。Ceccarelli等[10]認為，副溶血弧菌多重耐藥的形成與耐藥基因隨可移動遺傳元件(如整合子、轉(zhuǎn)座子、質(zhì)粒等)在菌株間的水平傳播密切相關。目前已知，磺胺類耐藥基因Sul1位于I型整合子的3'末端，而整合子通常存在于可移動的質(zhì)粒或轉(zhuǎn)座子上；ant(3")-I位于質(zhì)粒或整合子的基因盒上介導氨基糖苷類的耐藥[11]；TEM是革蘭氏陰性菌最常見的β-內(nèi)酰胺類耐藥基因，由質(zhì)粒編碼[12]；tet(A)為革蘭氏陰性菌最主要的四環(huán)素類耐藥基因，通常位于轉(zhuǎn)座子或質(zhì)粒上[13]。關于水產(chǎn)動物源副溶血弧菌的耐藥基因，Yutaka等[6]檢測了泰國蝦源副溶血弧菌β-內(nèi)酰胺類和四環(huán)素類耐藥基因的攜帶情況，婁陽等[14]分析了上海水產(chǎn)品源副溶血弧菌β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、氯霉素類、氨基糖苷類耐藥基因的分布。【本研究切入點】副溶血弧菌的耐藥性和耐藥機制日益受到人們的重視。但目前副溶血弧菌耐藥性研究主要集中于耐藥表型，有關病原菌耐藥表型與耐藥基因型相關性以及廣西對蝦源副溶血弧菌耐藥基因的研究報道仍屬鮮見。【擬解決的關鍵問題】對分離自廣西沿海養(yǎng)殖凡納濱對蝦的30株副溶血弧菌進行藥敏試驗，并檢測4種不同類別耐藥基因的攜帶情況，分析對蝦源副溶血弧菌耐藥表型與耐藥基因之間的相關性，為凡納濱對蝦弧菌病防控提供科學指導，為副溶血弧菌耐藥機制的深入研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

試驗菌株為2014-2016年廣西水生動物病害診斷實驗室于廣西欽州市、防城港市和北海市從凡納濱對蝦肝胰腺分離并鑒定保存的30株副溶血弧菌。其中，來自欽州市14株，防城港市9株，北海市7株(表1)。

表1 株來源信息

1.2 主要試劑

PCR擴增引物由生工生物工程技術服務(上海)有限公司合成。PCR緩沖液、dNTPs、Taq聚合酶、MgCl2、ddH2O均購于寶生物工程(大連)有限公司。瓊脂糖購于美國Invitrogen公司。細菌基因組DNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司。引物設計參考Bryan等[15]，序列及產(chǎn)物長度見表2。

12種藥敏片均購自杭州天和微生物試劑有限公司，包括β-內(nèi)酰胺類：青霉素G(PG，10 μg/片)、氨芐青霉素(AMP，10 μg/片)；四環(huán)素類：多西環(huán)素(DOX，30 μg/片)；氯霉素類：氟苯尼考(FFC，30 μg/片)；氨基糖苷類：新霉素(NEO，30 μg/片)、鏈霉素(STR，10 μg/片)、慶大霉素(GEN，10 μg/片)；喹諾酮類：恩諾沙星(ENR，30 μg/片)、環(huán)丙沙星(CLX，5 μg/片)；磺胺類：復方磺胺嘧啶(SDM，25 μg/片)、磺胺二甲嘧啶(SMD，25 μg/片)；大環(huán)內(nèi)酯類：紅霉素(ERY，15 μg/片)。所有試驗用藥敏片均保存于4 ℃冰箱備用。

表2 4種耐藥基因PCR擴增引物序列

表3 4種耐藥基因的PCR反應條件

1.3 藥敏試驗

采用Kirby-Bauer(K-B)紙片擴散法進行藥物敏感性試驗。參照美國臨床和實驗室標準協(xié)會(CLSI)抗生素敏感試驗標準，將每種抗生素的藥敏結果用S(敏感)、I(中介)、R(耐藥)進行記錄。

1.4 耐藥基因的PCR檢測

按試劑盒說明書提取細菌基因組DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?種耐藥基因的PCR反應條件見表3。反應體系(25 μl)：PCR緩沖液2.5 μl，dNTPs 0.5 μl，MgC122.5 μl，上下游引物各1 μl，Taq聚合酶0.3 μl，DNA模板3 μl，ddH2O補足余量。擴增條件[15]見表3。PCR反應結束后以1.0 %瓊脂糖凝膠在100 V電壓下電泳35 min，凝膠成像分析系統(tǒng)(北京六一，WD-9413B)觀察電泳結果。PCR產(chǎn)物由生工生物工程技術服務(上海)有限公司測序。采用ClustalX及DNAstar軟件進行核苷酸序列一致性分析以及系統(tǒng)發(fā)育樹構建。

對未出現(xiàn)預期條帶的菌株，退火溫度以上述各溫度為中心溫度，±5 ℃再做梯度PCR并調(diào)試其他條件，反復試驗仍無預期條帶出現(xiàn)者視為所檢測基因檢測結果陰性。

1.5 統(tǒng)計分析

耐藥表型與耐藥基因的符合率計算公式：

符合率(%)=攜帶耐藥基因并具有相應耐藥表型菌株數(shù)÷具有相應耐藥表型菌株總數(shù)。

使用SPSS 18.0中Fisher’s exact test進行菌株耐藥表型和耐藥基因的相關性分析。

2 結果與分析

2.1 副溶血弧菌藥物敏感性

檢測的副溶血弧菌對12種抗生素存在不同程度的多重耐藥現(xiàn)象(表4)，其中，6重耐藥1株(3.3 %)，5重耐藥3株(10.0 %)，4重耐藥10株(33.3 %)，3重耐藥13株(43.3 %)。30株副溶血弧菌的優(yōu)勢耐藥譜是SDM/SMD/PG/AMP和SMD/PG/AMP，所含菌株數(shù)分別占被檢菌株數(shù)的23.3 %和20.0 %，其余依次為DOX/SDM/SMD/PG/AMP、SDM/SMD/PG、DOX/SMD/PG、SMD/PG(各占6.7 %)，PG/AMP/ERY、SMD、STR/SMD/PG、STR/SMD/PG/AMP、SMD/PG/CLX、GEM/SMD/PG/AMP、GEN/SDM/SMD/PG/AMP、GEN/DOX/SDM/SMD/PG/AMP、DOX/SMD/PG/AMP(各占3.3 %)。

表4 30株副溶血弧菌菌株的藥物敏感性

續(xù)表4 Continued table 4

菌株Strain氨基糖苷類Aminoglycoside四環(huán)素類Tetracycline磺胺類Sulfanilamideβ-內(nèi)酰胺類β-lactam氯霉素類Chloram-phenicol喹諾酮類Quinolone大環(huán)內(nèi)酯類Macrolide新霉素Neomycin鏈霉素Streptomycin慶大霉素Genta-mycin多西環(huán)素Doxyc-ycline復方磺胺嘧啶Sulfadiazine磺胺二甲嘧啶Sulfadimidine青霉素Penicillin G氨芐青霉素Ampicillin氟苯尼考Florfenicol恩諾沙星Enrofloxacin環(huán)丙沙星Ciprofloxacin紅霉素ErythromycinQZ08SSSSIRRRSSSSQZ09SISSIRRRSSSSQZ10ISSSRRRISSSSQZ11SSSSIRRRSSSSQZ12ISIRIRRSSSSSQZ13SSSSIRIISSSSQZ14SSSRRRRRSSSSFCG01SSSSIRRRSSSSFCG02SSSSRRRRSSSSFCG03SSSRIRRRSSSSFCG04SSSRIRRISSSSFCG05ISRSIRRRSIISFCG06IRSIIRRRSSSSFCG07SRSIIRRISSSSFCG08SSSSIRRISSSSFCG09SSSSIRRRSSSSBH01SSISIRRSSSSIBH02SSISIRRISSRSBH03ISRIRRRRIIIIBH04ISRRRRRRSSSSBH05SSSSRRRRSISIBH06SSISRRRRSSSIBH07SSSSRRRISSSS

PG：青霉素；G；AMP：氨芐青霉素；SDM：復方磺胺嘧啶；SMD：磺胺二甲嘧啶；DOX：多西環(huán)素；ERY：紅霉素；FFC：氟苯尼考；NEO：新霉素；STR：鏈霉素；GEN：慶大霉素；ENR：恩諾沙星；CLX：環(huán)丙沙星PG:Penicillin G; AMP:Ampicillin; SDM:Sulfadiazine; SMD:Sulfadimidine; DOX:Doxycycline; ERY:Erythromycin; FFC:Florfenicol; NEO:Neomycin; STR:Streptomycin; GEN:Gentamycin; ENR:Enrofloxacin; CLX:Ciprofloxacin圖1 副溶血弧菌菌株對抗生素的耐藥情況比較Fig.1 Comparison of resistant situation of Vibrio parahaemolyticus strains against antibiotics

M為100 bp DNA ladder，N為陰性對照;1～9為被檢測的部分菌株M indicates the 100 bp DNA ladder, N indicates the negative control; Lane 1-9 indicate some strains detected圖2 部分菌株4種耐藥基因的PCR擴增結果Fig.2 PCR amplification results of four kinds of antibiotics resistance genes in some strains

30株副溶血弧菌對12種抗生素的耐藥程度也不同(圖1)，對β-內(nèi)酰胺類和磺胺類抗生素的耐藥性相對較高，對青霉素G、氨芐青霉素的耐藥率分別為96.7 %和70.0 %，對磺胺二甲嘧啶、復方磺胺嘧啶的耐藥率分別為96.7 %和43.3 %，遠超過其他類抗生素的耐藥率。所有菌株對新霉素、氟苯尼考、恩諾沙星均為敏感或中介；其中，對氟苯尼考的敏感率最高，達96.7 %，對新霉素、鏈霉素、慶大霉素、多西環(huán)素、恩諾沙星、環(huán)丙沙星和紅霉素的敏感率為70.0 %～90.0 %。

2.2 副溶血弧菌的耐藥基因檢測結果

以30株副溶血弧菌的總DNA為模板，采用PCR方法擴增4種耐藥基因。4種耐藥基因的PCR擴增結果見圖2。部分受試菌株能擴增出大小約為284 bp的ant(3")-I基因、408 bp的Sul1基因和800 bp的TEM基因片段，與預期產(chǎn)物大小相符。將陽性PCR擴增產(chǎn)物進行測序，并將所得序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中的相應基因序列進行比對，結果顯示，PCR陽性樣品測序片段與NCBI數(shù)據(jù)庫中的對應基因序列相似性高。經(jīng)反復試驗，均未擴增出tet(A)目的條帶，表明所有供試菌株均不攜帶tet(A)基因。

根據(jù)檢測結果(表5)，30株受試菌株的ant(3")-I、Sul1、tet(A)、TEM基因的檢出率分別為6.7 %(2/30)、43.3 %(13/30)、0.0 %(0/30)和13.3 %(4/30)。共包含5種耐藥基因型，即ant(3")-I-Sul1+tet(A)-TEM-、ant(3")-I-Sul1-tet(A)-TEM-、ant(3")-I-Sul1-tet(A)-TEM+、ant(3")-I+Sul1-tet(A)-TEM-和ant(3")-I-Sul1+tet(A)-TEM+，分布率依次為40.0 %(12/30)、40.0 %(12/30)、10.0 %(3/30)、6.7 %(2/30)、3.3 %(1/30)。

表5 副溶血弧菌菌株耐藥基因的檢測結果

圖3 基于ant(3")-I部分序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of partial sequences of ant(3")-I

在30株受試菌株中，只有FCG01和FCG03菌株攜帶ant(3")-I基因，GenBank登錄號分別為MG870346和MG870347。基于284 bp的ant(3")-I部分序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)，可見菌株FCG01和FCG03的ant(3")-I部分序列與副溶血弧菌(V.parahaemolyticus，MF627445.1)、霍亂弧菌(V.cholerae，HM015625.1)、殺鮭氣單胞菌(Aeromonassalmonicida，MF495478.1)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae，MF582638.1)、銅綠色假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，MF144194.1)聚為一支，在進化關系上比較近；與弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii，AF458081.1)、鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonellatyphimurium，AF203817.1)在進化關系上距離較遠。基于ant(3")-I部分序列，與副溶血弧菌、殺鮭氣單胞菌、肺炎克雷伯氏菌、銅綠色假單胞菌、霍亂弧菌、鼠傷寒沙門氏桿菌、弗氏檸檬酸桿菌的核苷酸一致性：FCG01分別為98.2 %、98.2 %、98.2 %、98.2 %、97.9 %、88.8 %和88.4 %；FCG03分別為99.6 %、99.6 %、99.6 %、99.6 %、99.3 %、89.9 %和89.5 %。

有4株菌株(QZ14、BH02、BH03和BH04)攜帶TEM基因，GenBank登錄號依次為MG870348、MG931979、MG931980和MG931981。基于TEM部分序列的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖4。根據(jù)圖4，4株菌株的TEM部分序列與副溶血弧菌(V.parahaemolyticus，JF327791.1)、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila，F(xiàn)J767900.1)、熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens，GU733416.1)聚為一支，在進化關系上比較近；與摩氏摩根氏菌(Morganellamorganii，GU011973.1)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae，LNIM01000067.1)、粘質(zhì)沙雷菌(Serratiamarcescens，AY538699.1)、大腸桿菌(Escherichiacoli，KU664682)在進化關系上距離較遠。基于TEM部分序列，與副溶血弧菌、嗜水氣單胞菌、熒光假單胞菌、摩氏摩根氏菌、肺炎克雷伯氏菌、粘質(zhì)沙雷菌、大腸桿菌的核苷酸一致性：QZ14分別為100 %、100 %、100 %、99.7 %、99.6 %、99.3 %和99.3 %；BH02分別為99.7 %、99.9 %、99.9 %、99.6 %、99.6 %、99.4 %、99.1 %和99.1 %；BH03分別為100 %、100 %、99.9 %、99.7 %、99.6 %、99.3 %和99.3 %；BH04分別為99.9 %、99.9 %、99.9 %、99.6 %、99.6 %、99.1 %和99.1 %。

檢測到Sul1基因的菌株有13株，分別為QZ01、QZ02、QZ03、QZ05、QZ06、QZ07、QZ08、QZ10、FCG02、FCG04、FCG06、BH01和BH03，GenBank登錄號依次為MG870352～MG870362、MG931977、MG931978。根據(jù)基于Sul1部分序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5)可知，上述菌株的Sul1部分序列與副溶血弧菌(V.parahaemolyticus，MF627445.1)、霍亂弧菌(V.cholerae，DQ227350.1)、大腸桿菌(Escherichiacoli，U04278.1)聚為一支，進化關系較近；與鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonellatyphimurium，DQ205474.1)序列在進化關系上相對較遠。DNAStar軟件分析結果顯示，本試驗被測菌株的Sul1部分序列與副溶血弧菌、霍亂弧菌、大腸桿菌核苷酸一致性均為100 %，與鼠傷寒沙門氏桿菌核苷酸一致性為97.7 %。

圖4 基于TEM部分序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of partial sequences of TEM

圖5 基于Sul1部分序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of partial sequences of Sul1

2.3 副溶血弧菌對4類抗生素耐藥表型與耐藥基因的相關性

在30株副溶血弧菌中，鏈霉素和慶大霉素耐藥表型與ant(3")-I基因之間符合率均為0 %，相關性不顯著(P>0.05，下同)。由于未檢測到對新霉素有抗性的菌株，因此新霉素耐藥表型與ant(3")-I基因之間的相關性無法計算。復方磺胺嘧啶耐藥表型與Sul1基因之間符合率為53.8 %，相關性不顯著。磺胺二甲嘧啶耐藥表型與Sul1基因之間符合率為41.4 %，相關性不顯著。由于未檢測到tet(A)基因，因此多西環(huán)素耐藥表型與tet(A)基因之間的相關性也無法計算。青霉素G的耐藥表型與TEM基因之間符合率為13.8 %，相關性不顯著。氨芐青霉素的耐藥表型與TEM基因之間符合率為14.3 %，相關性不顯著(表6)。

表6 副溶血弧菌對4類藥物耐藥性和耐藥基因的相關性

注：“-”表示無法計算。括號外的數(shù)字為耐藥基因為陽性的菌株數(shù)量，括號里的數(shù)字為對應耐藥表型的菌株總數(shù)。

Note:‘-’ indicates that the value could not be calculated. The number outside the bracket indicated the quantity of strains which carry the resistance gene, and the number inside the bracket indicated the quantity of strains possessing the relevant antibiotic resistance.

3 討 論

3.1 廣西凡納濱對蝦源副溶血弧菌的耐藥性

水生養(yǎng)殖動物源副溶血弧菌的耐藥現(xiàn)象普遍存在，在本試驗中，廣西沿海凡納濱對蝦源副溶血弧菌對青霉素G和氨芐青霉素耐藥程度較高，與在浙江海產(chǎn)品[7]、江蘇凡納濱對蝦[8]源弧菌中的研究結果類似，這可能是因為青霉素G主要對革蘭氏陽性菌有效；而氨芐青霉素雖具有廣譜抗菌活性，但弧菌可能容易對其發(fā)生耐藥[6]。本試驗中，試驗菌株對復方磺胺嘧啶和磺胺二甲嘧啶耐藥率較高，與對浙江海產(chǎn)品來源副溶血弧菌的研究結果[7]相似；試驗菌株也具有一定的多重耐藥性。有學者認為，由于磺胺類濫用現(xiàn)象嚴重，目前在我國環(huán)境中磺胺類的檢出率與濃度遠高于其他國家[16]，因而推測副溶血弧菌對磺胺類的耐藥程度可能與環(huán)境中的磺胺類殘留量較高有關，多種抗生素可在蝦池中長期存在，并誘導水體細菌產(chǎn)生耐藥性，同時造成耐藥基因的廣泛傳播[16]。但2013-2015年，本研究團隊對某公司設在沿海各地的5個漁藥銷售店進行初步調(diào)查結果，抗生素類藥物在廣西沿海的銷售量很少，所調(diào)查的5個漁藥店基本上不銷售抗生素類藥物；另對廣西沿海近6500 hm2蝦塘的調(diào)查結果也證明，在對蝦養(yǎng)殖過程中極少使用磺胺類等抗生素類藥物，蝦病都是通過改水、控料等方法進行防控，一旦發(fā)生蝦病，幾乎都是即賣或排塘。表明導致本試驗的試驗菌株對復方磺胺嘧啶和磺胺二甲嘧啶耐藥率較高和多重耐藥性形成的原因較為復雜，除與抗生素的濫用有關外，可能還與其他因素有關。總之，在對蝦等水生動物養(yǎng)殖過程中，建議養(yǎng)殖戶在選擇用藥時應以藥敏試驗結果為依據(jù)，做到科學用藥。根據(jù)本試驗結果，雖然氟苯尼考的敏感率達96.7 %，可作為廣西沿海凡納濱對蝦副溶血弧菌病防控的首選藥物，但也不可亂用和濫用，以最大限度減少耐藥菌株的產(chǎn)生。

3.2 4類耐藥基因檢測以及與耐藥表型的相關性

在耐藥基因攜帶情況與耐藥表型相關性的研究結果中，靳曉敏等[15]認為，ant(3")-I為弧菌主要的氨基糖苷類修飾酶，能使游離羥基核苷化從而導致細菌產(chǎn)生耐藥性[15]。但在本試驗中，攜帶ant(3")-I的2株副溶血弧菌均對3種氨基糖苷類藥物敏感。在對單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)的研究中也有類似結果，這一現(xiàn)象被認為是ant(3")-I基因需在一定條件下才能表達功能蛋白[17]。Sul1基因編碼的二氫葉酸合成酶能保護細菌不被磺胺類所抑制[15]。而本試驗攜帶Sul1基因的13株副溶血弧菌中，有6株對復方磺胺嘧啶中介、1株對磺胺二甲嘧啶中介，可見Sul1和磺胺類耐藥表型間并非完全對應，這是否與菌株生理條件或環(huán)境導致Sul1控制的性狀未能得到有效表達有關尚待進一步深入研究。tet(A)為革蘭氏陰性菌最主要的四環(huán)素類耐藥基因，其編碼的tet(A)蛋白可將抗生素外排至細胞外導致細菌耐藥[13]，本試驗在30株試驗菌株中均未檢測到tet(A)基因，與對大菱鲆源鰻弧菌的檢測結果[15]一致。盡管未檢測到tet(A)，仍有13.3 %的試驗菌株對多西環(huán)素耐藥。已知四環(huán)素類耐藥機制除tet(A)介導的外排泵機制外，還有核糖體保護和四環(huán)素類鈍化機制等[18]，據(jù)此推測，本試驗的副溶血弧菌對四環(huán)素類抗生素可能存在其他耐藥機制。TEM是革蘭氏陰性菌最常見的β-內(nèi)酰胺類耐藥基因，其編碼的β-內(nèi)酰胺酶可水解各類青霉素類[12]。本試驗TEM的檢出率(13.3 %)低于寧波(91.47 %)[19]而高于泰國(0 %)[6]。造成TEM檢出率不同的原因可能與細菌宿主及所處環(huán)境、地理位置、檢測條件等不一致有關。本試驗中青霉素G、氨芐青霉素的耐藥表型和TEM相關性不顯著(P>0.05)，有學者認為菌株對青霉素G、氨芐青霉素的耐藥性可能還受環(huán)境的抗生素含量、耐藥基因拷貝數(shù)等影響[20]。

據(jù)本試驗結果，未發(fā)現(xiàn)4類抗生素耐藥表型和耐藥基因之間存在顯著相關性，綜合前人的研究成果，認為原因可能有：①菌外膜蛋白有可能參與調(diào)節(jié)抗生素經(jīng)細菌外膜的通透性[21]。如副溶血弧菌具有外膜蛋白復合物VmeA-VmeB-vpoC，該復合物可將抗生素泵出細菌胞外以達到耐受抗生素的目的[22]。②不同菌株其基因拷貝數(shù)不一，導致部分菌株耐藥基因未被檢出[20]。③一些耐藥基因在染色體、質(zhì)粒及其他可移動遺傳元件上的分布情況復雜，其有效表達受到各種因素影響[10]。I型整合子耐藥基因(如ant(3")-I和Sul1)與整合酶基因intI的表達呈此消彼長的狀況[23]。位于轉(zhuǎn)座子上的tet(A)基因其轉(zhuǎn)錄和翻譯受啟動子、莖環(huán)結構的影響[18]。④不同菌株其耐藥基因啟動子強弱不一[20]，如I型整合子中耐藥基因ant(3")-I和Sul1的表達與啟動子的種類、強弱以及與啟動子的距離密切相關[23]。TEM基因4種啟動子強弱順序為P4>Pa/Pb>P3[24]。⑤菌株可能存在其他耐藥基因介導的耐藥機制等。例如當外部環(huán)境條件不適宜細菌生存時，細菌可通過整合外源耐藥基因及調(diào)節(jié)整合子中下游基因盒的表達以適應外部變化[23]。⑥細菌耐藥形成與抗生素使用方式有關。如嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)等病原菌在亞抑菌濃度誘導下可以獲得對氟苯尼考等抗生素的高耐藥性[25-26]。可見，除了耐藥基因，副溶血弧菌對4類抗生素的耐藥性可能還受上述6個方面情況的影響，導致本試驗4類抗生素耐藥表型和耐藥基因之間的相關性不顯著。但由于許多耐藥基因可以隨可移動遺傳組件在菌株之間水平轉(zhuǎn)移[10]，耐藥基因的存在給凡納濱對蝦弧菌病防控帶來的風險仍需引起高度重視。總之，建議加強細菌耐藥監(jiān)測和耐藥基因的研究，以提高凡納濱對蝦弧菌病防控效率，同時為進一步弄清弧菌耐藥機制提供依據(jù)。

4 結 論

廣西沿海30株凡納濱對蝦源副溶血弧菌對磺胺二甲嘧啶和青霉素G耐藥性最強，對氟苯尼考敏感性最高。30株弧菌的優(yōu)勢耐藥基因型是ant(3")-I-Sul1+tet(A)-TEM-和ant(3")-I-Sul1-tet(A)-TEM-。4類抗生素耐藥基因與耐藥表型之間均未發(fā)現(xiàn)顯著相關性。