當歸揮發油對人肺腺癌GLC-82細胞增殖及細胞周期的影響*

張正順 ，張艷霞 ，陳紹儀 ，孔學禮 ，周佳瑋

1甘肅省中醫院白銀分院，甘肅 白銀 730900；2甘肅中醫藥大學/甘肅省中藥藥理與毒理學重點實驗室/甘肅省高校中（藏）藥化學與質量研究省級重點實驗室；3白銀市第二人民醫院

當歸為傘形科植物當歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels.的干燥根，為常用中藥，具有調經止痛、補血活血、潤腸通便之功效［1］。現代藥理研究表明當歸的有效成分有抗腫瘤作用，但當歸提取物對腫瘤細胞生長的影響報道顯示不一致，甚至有作用相反的研究報道，臺灣學者Chang等［2］研究發現當歸中提取的阿魏酸具有促進MCF-7細胞生長的作用。Kim等［3］研究發現當歸的呋喃類化合物體外具有抑制A549、SK-MEL-2等細胞生長的作用。朱曉音等［4］研究發現當歸水提物有刺激人宮頸癌HeLa細胞、人乳腺癌MDA-MB-435細胞增殖的作用。而當歸揮發油能夠明顯抑制人宮頸癌HeLa細胞、人前列腺癌PC3細胞、人乳腺癌MDA-MB-435細胞增殖。這些結果提示當歸中不同提取成分對腫瘤細胞生長的影響可能不同，甚至相反。當歸中主要成分之一當歸揮發油對肺癌細胞的生長及周期是否有作用，目前尚不確定，本研究采用噻唑藍（MTT）法研究當歸揮發油對人肺腺癌GLC-82細胞的細胞毒作用，并應用流式細胞術檢測其對細胞周期的影響，初步探討當歸揮發油對GLC-82細胞增殖及周期的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物 當歸揮發油由岷縣康達藥業開發有限責任公司提供，制備方法為稱取當歸飲片1 kg，應用置超臨界萃取設備進行CO2超臨界流體萃取，CO2流量 2 L/（kg·h）、壓力 25 MPa、萃取溫度40℃，時間6小時，所得當歸萃取液過濾，濾液靜置后取油層，得8.2 g揮發油，當歸揮發油含量為每100 g藥材含0.82 g，所得當歸揮發油經GC-MS分析，藁本內酯含量為81.4%。卡鉑注射液（齊魯制藥有限公司，批號：WB1J1402001，規格：50mg/10mL）。

1.2 試劑 胎牛血清 FBS Premium，cat.No：P30-3302，Lot.No：P1410047（杭州四季青生物工程有限公司產品，批號：140126）；RPMI 1640培養基（Gibco Invitrogen Corporation，U.S.A.產品）；噻唑藍（MTT，Solarbio 公司產品，Lot.No.3D3H0511，Exp.20200617）；胰酶細胞消化液（Biosharp 公司產品，產品編號：BL512A）；十二烷基硫酸鈉（SDS，solarbio 公 司 產 品 ，Lot.NO.325E035）；雙 抗（Beyotime 公司產品，編號：C0222）；磷酸鹽緩沖液（PBS，0.006 7 M，Hyclone 產品）；細胞周期試劑盒 （#CCS012 Cell cycle staining kit，LOT#：6223805，聯科生物產品）。

1.3 細胞系 人肺腺癌GLC-82細胞購自中科院上海細胞生物研究所細胞庫，由蘭州大學基礎醫學院藥理學研究所傳代保種。用含10%小牛血清及含1%雙抗（1×105IU/L青霉素和1×105IU/L鏈霉素）的RPMI 1640培養基，37℃、5%CO2及飽和濕度條件下在培養箱中培養，本細胞為貼壁細胞，傳代時用0.25%胰蛋白酶消化液消化，2～3天傳代1次。

1.4 儀器 MCO-15AC型CO2培養箱（日本三洋科研醫療設備公司產品）；HF safe 760S型超凈工作臺（香港力康儀器有限公司產品）；Epoch型全波長酶標儀/超微量微孔板紫外分光光度計（Bio-tec公司產品）；流式細胞儀（BD FACSVerseTM流式細胞儀，USA產品）；IX71-22PH型倒置顯微鏡（OLYMPUS產品）；80-1型離心機（金壇市恒豐儀器廠）；GR60DR型全自動高壓滅菌器[致微（廈門）儀器有限公司]；PB-21型PH計（賽多利斯科學儀器有限公司）。

1.5 方法

1.5.1 M TT法測定當歸揮發油對人肺腺癌G LC-82細胞增殖的抑制作用 取對數生長期GLC-82細胞，制備細胞濃度為1×105/mL的細胞懸液，以90 μL/孔加入96孔培養板中。實驗分空白對照組、陰性對照組、當歸揮發油系列濃度（6.25、12.5、25、50、100、150、200 μg/mL）組及相應的顏色對照組。培養24小時后細胞貼壁，加入藥物（10 μL/ 孔），繼續培養44小時，加入MTT（10μL/孔），再培養 4小時后加入 10%SDS（100 μL/ 孔），置培養箱中過夜，次日于波長570 nm處測定吸光值。計算當歸揮發油對GLC-82細胞的抑制率（IR），公式如下：

1.5.2 倒置顯微鏡觀察細胞生長形態 取對數生長期的GLC-82細胞，制備濃度為1×105/mL的單細胞懸液，接種于培養瓶內，分陰性對照組、當歸揮發油（25、50、75、100、200 μg/mL）組。培養 24小時待細胞貼壁后，分別以每瓶1 mL加入藥物或生理鹽水，繼續培養48小時。于倒置顯微鏡下觀察細胞形態。

1.5.3 流式細胞儀檢測細胞周期 取對數生長期的GLC-82細胞，調節細胞濃度至1×105/mL，以每瓶9 mL接種100 mL容量的10個培養瓶內，分別作為陰性對照組及當歸揮發油25、50 μg/mL濃度組。培養24小時待細胞貼壁后，分別以每瓶1 mL加入藥物或生理鹽水，繼續培養48小時。實驗終止時收集細胞沉淀，然后按下述步驟操作：1）用預冷的PBS洗1遍，離心，棄去上清；2）加入1 mL的DNA染色液和10 μL的破膜劑，渦旋混勻5～10秒。室溫孵育30分鐘。3）流式分析：孵育完的細胞懸液直接上機。

1.6 統計學方法 采用SPSS 13.0軟件分析數據，計量資料以（±s）表示，采用t檢驗，MTT 測定中半數抑制濃度（IC50）用Curve Expert 1.3軟件做曲線回歸計算，檢驗水準為α=0.05。

2 結果

2.1 當歸揮發油對人肺腺癌G LC-82細胞增殖的抑制作用 當歸揮發油對GLC-82細胞的增殖具有抑制作用，在濃度為6.25～200 μg/mL的劑量范圍內呈濃度依賴性。當歸揮發油對GLC-82細胞的IC50為 113.03 μg/mL，見表 1。

表1 培養48 h當歸揮發油對G LC-82增殖的抑制作用（±s）

表1 培養48 h當歸揮發油對G LC-82增殖的抑制作用（±s）

注：與陰性對照組比較，*表示 P＜0.05，**表示P＜0.01；每板各濃度設3個復孔，為1次實驗數據

組別 例數 劑量/（μg·m L-1） O D值 IR/%陰性對照組 4 0 0.58±0.09 -6.25 0.53±0.00 0.59±0.12 12.5 0.56±0.08 4.44±2.92 25 0.55±0.09 6.62±2.81當歸揮發油組 4 50 0.47±0.13 20.12±14.40 100 0.36±0.10*36.74±23.02 150 0.14±0.06**75.77±9.39 200 0.06±0.04**89.81±4.79

2.2 倒置顯微鏡觀察G LC-82細胞生長形態 陰性對照組GLC-82細胞結構完整，生長旺盛，折光率較高，胞體大，形態多邊形，胞質均勻透明，隨培養時間延長后形態無明顯變化。當歸揮發油處理后細胞形態發生改變，細胞結構逐漸固縮變圓并與周圍細胞分離，折光率減弱，貼壁細胞減少，部分細胞脫落懸浮于培養瓶中，部分細胞裂解。隨著藥物濃度的增加，細胞皺縮越明顯，死亡細胞逐漸增多。濃度為200 μg/mL時已經沒有形態完整的貼壁細胞，細胞多呈亮色圓形漂浮在培養液中，見圖1。

圖1 當歸揮發油對G LC-82細胞形態的影響

2.3 當歸揮發油對不同細胞周期中G LC-82的影響 當歸揮發油各劑量組與陰性對照組比較，G1期GLC-82細胞明顯減少，G2期GLC-82細胞明顯增多，差異有統計學意義（P＜0.01），該變化呈濃度依賴性，見表2及圖2。

表2 培養48小時當歸揮發油對不同細胞周期中G LC-82細胞的影響（±s） %

表2 培養48小時當歸揮發油對不同細胞周期中G LC-82細胞的影響（±s） %

注：與陰性對照組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01

組別 例數 G 1 S G 2陰性組 3 64.66±1.15 23.54±1.35 3.53±0.70當歸揮發油 25 μg/m L組 3 56.82±0.73** 24.67±2.13 13.32±0.09**當歸揮發油 50 μg/m L組 3 45.89±1.88** 28.68±0.85 21.55±1.13**

圖2 當歸揮發油對不同細胞周期中G LC-82細胞的影響（48 h）

3 討論

肺癌是嚴重危害人類健康的惡性腫瘤之一，其發病率及死亡率一直呈上升趨勢，是目前全世界發病率和死亡率最高的癌癥，平均每30秒就有1 人死于肺癌［5］。肺癌是我國的第一大癌癥［6］。非小細胞肺癌（NSCLC）占肺癌的80%左右，近年來，NSCLC治療手段及化療新藥層出不窮，但療效未得到進一步提高［7-8］，因此，推出高效低毒的新化療藥物是提高療效的關鍵。近年來，隨著中醫藥治療腫瘤的不斷發展，越來越多的中藥提取物對肺癌細胞生長的抑制作用得到肯定，中藥單藥有效成分的研究成為熱點［9］，例如，Xie 等［10］研究發現，茯苓皮提取物丹參酮ⅡA可誘導細胞凋亡和周期阻滯；王家曉等［11］研究發現，人參皂苷Rg3可明顯誘導、提高荷瘤小鼠特異性抗腫瘤免疫反應；喜樹果中含有的喜樹堿、羥基喜樹堿等對肺癌有顯著療效［12］；丹參中提取的丹參酮類物質對腫瘤細胞具有直接殺傷作用，且可誘導腫瘤細胞凋亡和分化［13］；山豆根中含有的苦參堿等可抑制腫瘤細胞的核酸代謝［14］。本研究結果表明當歸揮發油在濃度為6.25～200 μg/mL的范圍內對GLC-82細胞的增殖具有濃度依賴性抑制作用，當歸揮發油對GLC-82細胞的 IC50為 113.03 μg/mL。

腫瘤的發生是一個多因素、多步驟、多基因和多階段改變的過程，其中細胞周期調控是腫瘤發生的重要機制［15］。本研究發現當歸揮發油各劑量組G2期細胞較陰性對照組明顯增多，且這種變化呈濃度依賴性。可以推斷，當歸揮發油可能通過阻滯細胞于G2期起到抑制GLC-82細胞增殖的作用。