黃芪總皂苷對心力衰竭大鼠JAK2和STAT3的影響*

李 亮 ，姬艷蘇

1天津醫科大學總醫院，天津 300052；2武警后勤學院附屬醫院

黃芪是臨床用于治療心力衰竭的常用中藥，黃芪皂苷是黃芪強心的主要成分，也是許多抗心力衰竭中成藥的重要組成［1］。酪氨酸激酶2/信號傳導及轉錄激活因子3（Janus activated kinase2/signal transducer and activator of transcription3，JAK2/STAT3）廣泛參與血管生成與細胞增殖、分化和遷移［2］。既往研究［3-4］發現黃芪總皂苷能增強心肌梗死大鼠左心室的結構和收縮功能，抑制心室重塑。羧基端活性段腦鈉肽（B-type natriuretic peptide，BNP）是國際公認的診斷心力衰竭的血清標志物，是心肌損傷高度

敏感和特異的指標，有助于評估心力衰竭的診斷和治療效果。本研究進一步觀察慢性心力衰竭大鼠微血管密度的變化，評價心肌JAK2/STAT3 mRNA和蛋白水平及黃芪總皂苷對JAK2/STAT3的干預作用，探討黃芪總皂苷抑制心室重塑、促進血管新生的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 Wistar大鼠70只，雄性，體質量200～220 g，由北京維通利華實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK（京），分籠飼養，每籠5只，食、水自由攝取。

1.2 主要儀器與試劑 ABI7300實時熒光定量系統（Applied Biosystems，美國）；DYY-IIIB 電泳儀（北京六一儀器廠）；轉膜裝置（Bio-Rad，美國）；GENE GENIUS凝膠成像系統（Bio Imaging System，SYNGENE，英國）。大鼠血清B型尿鈉肽測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20150415）；Trizol Reagent（invitrogen）；Reverse Transcription Reagents Kit；Power SYBR Green PCR Master Mix Reagents Kit（Applied Biosystems，美國）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物技術研究所），小鼠抗大鼠抗體：VⅢ因子（Santa Cruz，美國），JAK2（ab39636，abcam，美國），STAT3（ab68153，abcam，美國），Actin（ab8226，abcam，美國）。黃芪總皂苷，純度72.7%，由西安開來生物工程有限公司提供（k150411）；卡托普利片（上海施貴寶制藥有限公司生產，批號：AAA6059）。

1.3 復制慢性心力衰竭模型及給藥方法 大鼠心肌梗死后心力衰竭模型的復制參照文獻［3］方法制作，采用結扎大鼠冠狀動脈左前降支造成急性心肌缺血后心力衰竭模型，以左心室射血分數（Ejection fraction，EF）＜60%作為模型成功的標準，剔除死亡和未達到心力衰竭標準的大鼠后，將其余模型成功大鼠隨機分為模型組、卡托普利50 mg/kg組及黃芪總皂苷10 mg/kg、20 mg/kg劑量組，每組8只，另設假手術組8只。灌服給藥，假手術組及模型組灌服等量蒸餾水，1次/d，連續給藥4周。

1.4 血清B型鈉尿肽前體物（N T-proBN P）含量檢測 給藥4周后于腹主動脈取血，離心后留取血清，采用ELISA法檢測血清NT-proBNP的含量。

1.5 心肌微血管密度（M V D）檢測 給藥結束后處死動物，取出心臟，取心尖處梗死區邊緣部分心肌組織，用石蠟包埋組織塊，制作6 μm切片，行特異性VⅢ因子免疫組化染色。在400倍光鏡下，每張切片中隨機觀察3處，行血管計數，血管內皮細胞均被染成黃、褐色，單個內皮細胞、內皮細胞簇、微小血管均予計數。

1.6 心肌BN P、JA K 2和STA T3m RN A表達檢測 總RNA的提取：采用Trizol法提取心肌組織總RNA，紫外分光光度計檢測RNA純度和含量，瓊脂糖凝膠電泳分析其完整性。取0.2μgRNA用于反轉錄。RNA反應體系為10×RT Buffer 1.0 μL，MgCl2（25 mmol）2.2 μL，deoxy NTPs Mixture（2.5 mmol）2.0 μL，Random Hexamers（50 μmol）0.5 μL，RNase Inhibitor（20 U/L）0.2 μL，Multi Scribe Reverse Transcriptase（50 U/ μL）0.25 μL。混合以上反應物，離心后的0.2 μg RNA用RNase-free water補足反應體系至 10 μL。反應條件：25℃ 10min，48℃30分鐘，95℃5分鐘。PCR反應體系為2×Master Mix 12.5 μL，Forward Primer 0.5 μL（200 nm/L），Reverse Primer 0.5 μL（200 nm/L），cDNA Sample 0.5 μL，RNase-freewater11μL，反應體系為 25μL。混合以上反應物，開始擴增，擴增條件為95℃預變性10分鐘，95℃15秒，60℃1分鐘，40個循環。反應結束后使用ABI7300實時熒光定量系統分析PCR過程中各檢測樣本的域值循環（threshold cycle，CT）數值，通過2-△△CT表示目的基因相對于β-actin的表達水平。引物序列如下：

1.7 心肌JA K 2和STA T3蛋白表達檢測 應用蛋白免疫印跡（Western-blot）技術檢測 JAK2和STAT3蛋白表達，提取心肌組織總蛋白，取1 μL蛋白質溶液，二聯喹啉酸（BCA）法進行蛋白定量，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白，電泳完畢將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，TBST洗膜，將聚偏二氟乙唏膜（PVDF）加入封閉液中，常溫搖動，封閉結束，加1 mL的JAK2和STAT3 單克隆抗體（1∶1000 稀釋），4℃過夜，棄去反應液，TBST清洗3次，10 min/次。在膜上加入熒光標記的二抗（1∶20 000稀釋），室溫下輕輕振蕩1小時后取出膜，在磷酸鹽緩沖溶液（PBS）中清洗3次，10 min/次。二抗孵育后在暗室內進行顯影和定影，標定蛋白marker，用凝膠成像系統分析與掃描。

1.8 統計學方法 使用SPSS 19.5統計軟件分析數據，計量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，檢驗水準為α=0.05。

2 結果

2.1 各組大鼠M V D、N T-proBN P及BN P m RN A的表達 造模后5周，心肌梗死大鼠EF值為（53.9±4.9）%，＜60%，與假手術組 EF 值（84.7±5.4）%比較差異有統計學意義，證明模型復制成功。與假手術組相比，慢性心力衰竭大鼠血漿NT-proBNP含量和心肌BNP mRNA水平均增加（P＜0.05），黃芪總皂苷各劑量組和卡托普利50 mg/kg組可降低血漿NT-proBNP含量，并下調心肌BNP mRNA表達（P＜0.05）；卡托普利、黃芪總皂苷各給藥組間各指標比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 各組大鼠M V D、N T-proBN P及BN P m RN A的表達（±s）

表1 各組大鼠M V D、N T-proBN P及BN P m RN A的表達（±s）

注：與假手術組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01;與模型組比較，#表示P＜0.05，##表示P＜0.01

組別 只數 M V D N T-proBN P含量/（pg·m L-1） BN P m RN A表達假手術組 8 - 637.57±44.65 1.04±0.29模型組 8 9.86±3.44 706.17±34.56* 2.01±0.55**黃芪總皂苷10m g/kg組 8 14.43±3.41# 670.00±47.14 0.92±0.34黃芪總皂苷20m g/kg組 8 15.14±4.34# 630.86±58.69# 1.08±0.33##卡托普利50m g/kg組 8 15.29±4.03# 639.86±37.31# 0.97±0.37##

2.2 各組大鼠JA K 2和STA T3 m RN A的表達 各組取6只大鼠進行比較。與假手術組比較，模型組大鼠心肌JAK2 mRNA表達升高而STAT3 mRNA和蛋白表達降低（P＜0.05）。黃芪總皂苷20 mg/kg劑量組及卡托普利組可下調JAK2 mRNA表達，上調STAT3 mRNA表達，與模型組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。與假手術組比較，模型組STAT3蛋白表達降低了50.7%（P＜0.01），黃芪總皂苷20 mg/kg劑量組能上調STAT3的蛋白水平，與模型組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。模型組大鼠心肌JAK2的蛋白表達較假手術組有升高趨勢，而各給藥組均有下調JAK2蛋白水平的趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05），見表 2、圖 1。

表2 各組大鼠JA K 2和STA T3 m RN A的表達（±s）

表2 各組大鼠JA K 2和STA T3 m RN A的表達（±s）

注：與假手術組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01;與模型組比較，#表示P＜0.05

組別 只數 JA K 2 STA T3 m RN A 蛋白 m RN A 蛋白假手術組 6 1.06±0.33 0.18±0.06 1.02±0.18 0.71±0.18模型組 6 1.61±0.58* 0.25±0.09 0.75±0.09** 0.35±0.13**黃芪總皂苷10 m g/kg組 6 1.45±0.36 0.21±0.08 0.62±0.13 0.31±0.05黃芪總皂苷20 m g/kg組 6 1.16±0.21# 0.20±0.07 0.83±0.21# 0.63±0.20#卡托普利50 m g/kg組 6 1.20±0.28# 0.20±0.08 0.91±0.20# 0.46±0.13

圖1 黃芪總皂苷對心肌梗死后心力衰竭大鼠JA K 2和STA T3蛋白表達的影響

3 討論

BNP是由心房和心室產生的一種肽類激素，心肌細胞首先合成BNP原，稱為proBNP，proBNP在蛋白酶的作用下裂解為NT-proBNP和生物活性激素BNP。兩種多肽等摩爾分泌并釋放入血循環，由于BNP的半衰期為22分鐘，而NT-proBNP的半衰期為120分鐘，而且體外穩定時間長達24小時，結合動物實驗取材和檢測時間，通過檢測血清中較穩定的NT-proBNP含量和心肌組織BNP的基因表達水平綜合評價BNP的變化情況。心力衰竭時BNP主要由心室細胞分泌，其合成與分泌主要受室壁張力調節，心力衰竭患者在循環容量超負荷時常合并左心室或全心擴大，引起室壁張力增加，BNP被大量合成并釋放入血，血中濃度明顯增高，能直接反映心功能損傷或衰竭狀態［5］。本研究發現心力衰竭大鼠血清NT-proBNP含量升高，BNP及基因表達上調，本課題組前期研究發現慢性心力衰竭大鼠左心室內徑和容積明顯增加，相應的室壁張力增強，而黃芪總皂苷可抑制心室重塑［3］，減小室壁張力并降低血清BNP濃度，證明黃芪總皂苷對慢性心力衰竭的治療效果。

心肌梗死后的血管新生是指將血管新生誘導因子轉入組織中，誘導缺血區側支毛細血管新生，改善缺血部位血供。應用藥物促進微血管新生，促進側支循環形成，完成缺血區血管的自我重建，是治療缺血性心臟病的有效手段。JAK2/STAT3通路是誘導血管內皮生長因子（VEGF）生成與遷移的關鍵環節，JAK2調控血管生成與細胞增殖、分化和遷移；STAT3是JAK2的重要底物，STAT3缺失時心肌毛細血管密度減少，梗死面積較正常增大，心臟功能受限，生存率下降。相反，STAT3過表達的大鼠梗死心臟中毛細血管密度增加，VEGF表達增加，梗死面積較野生型小［6］。STAT3的蛋白水平和活性的提高對早期和后期心肌缺血有保護作用，能調控在體心肌血管生長，有助于心臟適應各種應激［2］。

黃芪總皂苷是黃芪的主要活性成分，其通過調節一氧化碳保護內皮細胞，促進內皮細胞的遷移和管腔形成，利于心肌缺血區血管數目的增加［7］。本課題組前期研究發現黃芪皂苷能增強心肌梗死大鼠的心臟收縮和舒張功能，抑制心室重塑，本研究中黃芪總皂苷對心力衰竭標志物BNP在基因和血清學水平方面都有明顯改善作用，在mRNA和蛋白水平對JAK2/STAT3通路有干預作用，提示黃芪總皂苷促進治療性血管新生可能與調節JAK2/STAT3通路有關。本研究為黃芪總皂苷促進心肌梗死后心力衰竭大鼠心肌血管新生的作用機制進行了初步探討，但關于黃芪總皂苷對心肌梗死后不同階段心肌血管新生的促進作用與途徑尚未明確，仍需進一步研究與探索。